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真核mRNA测序分析的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA的总和。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点,通过新一代高通量测序,能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。



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寨卡病毒扰乱小鼠神经前体细胞发育并导致小头畸形


Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice


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ZIKV 在小鼠胚胎脑组织高效的复制引起小头畸形

将不同浓度的寨卡病毒ZIKV SZ01 或mock-ZIKV(对照组)注射到发育13.5天(E13.5)的小鼠胚胎侧脑室,3-5天后检查结果,并对结果进行qPCR和免疫组化验证。研究发现,小鼠胚胎脑组织感染3天后病毒RNA复制量增加了300倍;大多数ZIKV感染的细胞分布在NPCs区域;感染后5天,感染组的脑组织更小。


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1 ZIKV在小鼠胚胎脑组织高效的复制引起小头畸形

ZIKV 感染导致 NPCs且能导致细胞死亡

为了鉴定ZIKV主要感染胚胎脑组织哪部分细胞,研究者检测了E16.5期的脑组织切片的一系列细胞标志物,结果显示ZIKV感染主要导致成熟和非成熟神经元的细胞死亡。同时信号强度显示发育中的脑组织NPCs区为ZIKV的主要直接感染靶标。


ZIKV 感染导致 NPCs细胞周期和分化的调节障碍

研究发现E16.5时,小鼠E13.5期感染脑组织VZ区的分裂细胞数目显著减少,同时伴随心室表面的中心体远离核心区,加上信号强度实验,都表明了M期NPCs 细胞数量减少。免疫组化相关实验也表明了ZIKV感染抑制了NPCs细胞周期和分化。


ZIKV 感染诱导产生免疫应答和小头畸形相关基因的表达失控

脑组织转录组测序结果表明,病毒感染3天后出现了大量的差异表达基因,GO分析显示免疫响应、细胞凋亡、细胞因子产生和响应过程显著富集。许多潜在黄病毒属病毒进入受体被诱导,预测为ZIKV受体。同时参与到细胞增殖、分化、转移和器官发育的许多基因表达量下调。参照ZIKV感染NPCs相关数据,参与到小头畸形相关的大部分基因显著下调,包括ASPMCASC5CENPFMCPH1RBBP8STILTBR2

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2  ZIKV 感染导致基因表达的全局失控



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研究发现SZ01通过直接靶向不同神经元排列在小鼠胚胎脑组织中高效复制;ZIKV感染导致细胞周期阻滞,细胞凋亡和NPCs分化受到抑制, 进而导致皮质萎缩和小头畸形。受感染脑组织的全基因组表达谱分析揭示了寨卡病毒潜在进入受体基因表达上调,免疫响应、细胞凋亡和小头畸形相关基因调节异常。该模型提供了寨卡病毒与小头畸形相关的直接证据。


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Li C, Xu D, Ye Q, Qin C F, Xu Z H, et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice[J]. Cell Stem Cell,  DOI:10.1016/j.stem.2016.04.017.

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Q做转录组测序一般需要测多大的数据量?


A转录组测序所需的测序量随研究目的的不同而有所差异。目前,为保证数据分析结果的可靠性和准确性,安诺基因推荐对有参考基因组的转录组采用最低6Gb clean data进行后续分析,如果想检测到低丰度的转录本推荐采用10Gb clean data。如果没有参考基因组,需要进行转录本的拼接组装,为了拼接组装的完整性,安诺基因推荐最低10Gb clean data的转录组测序。


Q转录组测序的技术重复性很高,那是否还有必要设生物学重复?


A

有必要,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。



Q无参转录组拼接注释后,能得到的注释基因有多少?


A注释基因的多少跟所研究的物种直接相关,如某些比较重要的物种基因研究的比较多,功能也比较清楚,注释得到的基因就会很多;反之则会比较少。




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