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单细胞全基因组甲基化测序(single-cell whole genome bisulfite sequencing , scWGBS)是基于单细胞水平的全基因组DNA,对其进行重亚硫酸盐处理,结合Illumina高通量测序平台,进行的全基因组甲基化水平研究。其结果将精确解析单细胞中每一个胞嘧啶的甲基化状态。对高异质性细胞表观遗传信息的发掘有重大意义。这一技术,为揭示胚胎的发育机制,进行癌症和不孕不育的研究治疗提供了可能。


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单细胞甲基化测序优势


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单细胞甲基化测序应用领域

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单细胞甲基化测序技术路线


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样品要求

1)细胞分离:由合作方完成单细胞分离;

2)由公司寄出样品保存液;

3)样品需求量:1-1000个新鲜细胞,样本体积尽量不超过1-2μl。 


其他要求

1)直接使用公司提供的0.2mL平盖PCR管作为采集管,管盖标注编号;细胞样本需采用不含Ca2+、Mg2+的缓冲液洗涤;裂解液避免反复冻融。注意避免起泡;


2)操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下(如冰上)。 样本采集管需要用Parafilm封口膜缠绕封口,装入PCR管盒,橡皮筋固定,再装入自封袋,-80℃暂存,大体积干冰运输;防止液体状态下管身颠倒使细胞附于采样管内壁上部;


3)送样量:单细胞基因组扩增,建议重复单细胞样本个数不小于3个;


4)  细胞采样后,请置于96孔管盒中,避免采样管倾倒,尽快寄送,若需保存请置于-80℃。


人类早期胚胎DNA甲基化全景图谱


The DNA methylation landscape of human early embryos


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研究背景


DNA甲基化在基因表达调控、基因印记的维持、X染色体失活状态的维持、以及抑制转座子重复序列的转座等方面都有非常重要的作用。然而,人类着床前胚胎发育的整个甲基化动态图谱由于技术难度和样本材料的获取局限性没法进行相关的研究。


本文利用微量细胞甚至单细胞DNA甲基化高通量测序技术,在国际上首次解析了人类早期胚胎发育过程中DNA甲基化调控网络,揭示了人类早期胚胎DNA去甲基化过程的异质性和其他独特特点。


2

设计思路


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研究结果


人类早期胚胎整个发育阶段DNA甲基化图谱的构建

利用微量细胞甚至单细胞DNA甲基化高通量测序技术,构建了人类早期胚胎发育过程中DNA甲基化的动态变化图谱。在受精之前,精子和卵细胞中的DNA甲基化程度都很高;而在受精之后,父母的表观遗传记忆都被大规模擦除,到植入前的囊胚阶段,胚胎的DNA甲基化水平降到最低点;但印记基因的DNA甲基化位点被精确维持和保留下来。


进一步研究发现,在受精之前,精子基因组DNA甲基化程度显著高于卵细胞,而在受精之后,来自精子的父源DNA去甲基化的速度快于来自卵细胞的母源DNA。到受精卵晚期,父源DNA甲基化程度已经低于母源DNA的甲基化程度;受精卵基因组DNA去甲基化过程呈现强烈的异质性,在相同发育阶段的不同受精卵中,基因组DNA的甲基化程度有显著差异。


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图1 人类早期胚胎整个发育阶段DNA甲基化图谱的构建

(a,人类早期胚胎各个发育阶段基因组区域上平均甲基化水平动态变化;b,人类早期胚胎发育甲基化图谱;c,精子和胚胎的甲基化水平比较;d,受精过程中,精子和卵细胞去甲基化水平的变化)

 

人类早期胚胎整个发育阶段中功能元件与基因表达的相关分析

在人类早期胚胎DNA甲基化组的大规模去甲基化过程中,相比于进化上更年轻、更活跃的转座子,进化上更古老的转座子重复序列上的DNA去甲基化程度更彻底,说明人类早期胚胎在植入前的发育过程中巧妙地在抹去表观遗传记忆和抑制转座子重复序列的转座活性之间取得了平衡;并发现在人类卵母细胞中的非CpG位点上存在相对较高的DNA甲基化修饰,并且发现基因区的非CpG位点的甲基化程度与相应基因的表达呈正相关关系,说明非CpG位点的甲基化水平可以调控基因的表达。


图2 人类早期胚胎整个发育阶段DNA甲基化,组蛋白修饰与基因表达的关系.png


图2 人类早期胚胎整个发育阶段DNA甲基化,组蛋白修饰与基因表达的关系.png 

图2 人类早期胚胎整个发育阶段DNA甲基化,组蛋白修饰与基因表达的关系.png

图2 人类早期胚胎整个发育阶段DNA甲基化,组蛋白修饰与基因表达的关系

(a, 人类早期胚胎各个发育histone mark和非histone mark位点的甲基化水平;b, 人类早期胚胎各个发育启动区甲基化水平与基因表达的关系;c, 人类早期胚胎发育阶段失活基因的功能分析)

 

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研究结论


本文全面分析人类早期胚胎DNA甲基化调控网络,构建了世界首个人类早期胚胎DNA甲基化全景图谱,对于加深对人类早期胚胎发育表观遗传调控机制的认识、改进辅助生殖技术的安全性评估、以及促进临床上早期胚胎发育异常疑难病例的诊治具有非常重要的意义。


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参考文献


Guo H, Zhu P, Yan L, et al. The DNA methylation landscape of human early embryos[J]. Nature, 2014, 511(7511): 606-610.

Q单细胞甲基化测序的覆盖度


A单细胞甲基化的建库过程,先对细胞进行BS处理,使DNA片段化的同时,将未甲基化的C转换为T,然后再加接头进行PCR建库。由于BS处理后,DNA会产生损失,因此文章中的覆盖度也只有8.5%~36.2%之间。如果可以多送细胞,将这些甲基化位点信息整合,可以得到更高的覆盖度论上。


Q单细胞甲基化样本的送样要求


A

取样体积越小越好,最多不可超过2μl,公司提供的管中含2μl PBS 。




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