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单细胞G&T-Seq:单细胞基因组与转录组平行测序技术(Genome and Tranome Sequencing),该技术实现了对单个细胞内的DNA和RNA平行测序,能够展现单个细胞的基因变异与基因功能之间的关系。


G&T-Seq这一整合的技术的重要意义在于可以分析单细胞基因型和表型之间的关系,深刻揭示一个细胞内的DNA信息指导细胞状态的调控机制,真正实现了在一个时空内遗传物质的综合研究。


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单细胞G&T-Seq优势.png


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单细胞G&T-Seq应用领域.png


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       样本要求

1)细胞分离:由合作方完成单细胞分离;

2)样品类型:活体新鲜完整细胞;不适于经固定、染色等处理的样本;

3)样品体积:在显微镜或其他设备辅助下分离,得到的单细胞样本体积以不高于1μl为宜;

4)送样量:建议重复单细胞样本个数不小于5个。

 

其他要求

1)直接使用公司提供的0.2mL平盖PCR管作为采集管,管盖标注编号;细胞样本需采用缓冲液洗涤;裂解液避免反复冻融。注意避免起泡;

2)操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下(如冰上)。 样本采集管需要用Parafilm封口膜缠绕封口,装入PCR管盒,橡皮筋固定,再装入自封袋,-80℃暂存,大体积干冰运输;防止液体状态下管身颠倒使细胞附于采样管内壁上部;

3)送样量:单细胞全转录组扩增,建议重复单细胞样本个数不小于5个;

       4)细胞采样后,请置于96孔管盒中,避免采样管倾倒,尽快寄送,若需保存请置于-80℃。


G&T-seq: 单细胞基因组和转录组平行测序技术


G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes


G&T-seq: 单细胞基因组和转录组平行测序技术.png


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研究背景


单细胞基因组测序对于揭示遗传异质性以及正常组织和病变组织之间的细胞谱系关系起着至关重要的作用,单细胞转录组测序则对于确定细胞不同亚型以及状态起着非常重要的作用;这里介绍一种新的研究方法—G&T-seq:对同一个细胞的基因组和转录组提供一种强有力手段来剖析遗传变异和其对基因表达的影响。G&T-seq有助于更深入的理解正常组织和疾病组织之间的遗传异质性,为人们研究发育和疾病发展提供新研究线索。


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图1 G&T-seq技术路线图

 

 

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设计思路


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研究结果


本研究利用G&T-seq测序研究同一个人的两种细胞(乳腺癌细胞和正常血细胞),发现正常细胞大多拥有两个拷贝的染色体,然而癌细胞往往存在染色体片段的缺失或冗余。数据分析并鉴定出正常细胞中的亚克隆(68、22、70、12号细胞存在11号染色体三体,82、56、79号细胞的16号染色体q臂缺失或者增加,并基于基因表达水平研究染色体三体、q臂缺失或增加的正常细胞(68、22、70、12、 82、56、79 ),在基因表达水平发生了上调或下调关系,表明染色体拷贝数和基因表达水平是正相关的,从而说明同一个细胞的基因组与表型之间的相互关系。


单细胞G&T-seq研究类淋巴细胞基因组结构变异与基因表达的相互作用.png


图2 单细胞G&T-seq研究类淋巴细胞基因组结构变异与基因表达的相互作用关系

 

研究人员通过G&T-seq对早期胚胎发育进行了研究,用化合物处理小鼠胚胎使其染色体不稳定,然后与正常小鼠胚胎进行比较。研究结果再次证明,当小鼠获得或者丢失染色体的时候,会立刻引起基因表达量的改变;进一步说明了当细胞丢失或获得染色体拷贝时,该区域的基因表达也会出现相应的变化(减少或者增加)。


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图3 单细胞G&T-seq研究胚胎细胞基因组结构变异与基因表达的相互作用关系


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研究结论


G&T-seq技术可以研究同一单细胞中基因型和表型的关系,同时定量一个单细胞中的基因组和转录组信息,有助于更深入的理解正常组织和疾病组织细胞之间的遗传异质性,为研究正常发育和疾病发展提供新思路。

 

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参考文献


Macaulay I C, Haerty W, Kumar P, et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes[J]. Nature Methods, 2015, 12(6): 519-22. 


Q单细胞G&T-seq技术原理


A单细胞分选(显微操作、流式细胞分选、激光显微切割、微流控芯片等技术)→细胞裂解释放mRNA和基因组DNA→5’端带有生物素标记的oligo-dT引物与含有plyA尾巴的mRNA结合→链霉亲和素磁珠可以和生物素特异性结合,从而富集mRNA→DNA和mRNA进行分离→分别进行单细胞基因组研究和单细胞转录组研究。


Q单细胞G&T-seq送样要求


A

单细胞G&T-seq的裂解液需单独申请,不能使用单细胞转录组或基因组裂解液替代,具体送样标准参考单细胞转录组送样标准。



Q单细胞G&T-seq数据质量


A对于单细胞G&T-seq技术来说,其最大的难点就是在mRNA和DNA分离的过程中,最大限度的减少mRNA和DNA的损失;针对这个技术缺陷经过长时间的优化,取得重大突破:利用Smart-seq2进行扩增获得转录组测序数据,其与基因组mapping率达到90%以上,能够检测到10000~12000个基因表达;利用MDA和MALBAC两种方法捕获基因组数据,基因组覆盖度能够达到90%以上,数据明显高于文献中大报道水平。具体数据见以下表格:


表1 单细胞转录组数据

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表2 单细胞基因组数据

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