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De novo测序即对被测基因组进行从头测序及拼接、组装,从而获得全基因组单碱基精度序列图谱。相对于全基因组重测序,de novo测序能够获得参考基因组序列中没有包含的个体基因组“新序列”,能够对个体基因组进行更完整的解读,采用全基因组de novo组装及信息分析可以更好地帮助了解个体遗传特征。全基因组序列图谱完成后,可以构建该物种的基因组数据库;为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台;为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。

 

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注:

1)样品需求量:小片段文库≥1 µg;2 Kb~6 Kb大片段文库≥20 µg;10 Kb大片段文库≥30 µg;20 Kb和40 Kb大片段文库≥60 µg;完成全基因组测序样品DNA量需求约为500 µg~1 mg;

2)样品浓度:小片段文库≥30 ng/µl,大片段文库≥133ng/µl;

3)样品质量:基因组完整。如需建立≥5 Kb的插入片段文库,要求普通琼脂糖电泳(推荐用0.6%凝胶,选用λ-HindIII digest或其它具有20Kb以上条带的ladder,80-120V电泳40-60min)结果,基因组DNA主带应在λ-HindIII digest最大条带23Kb以上,若有脉冲场电泳结果,则DNA主带应在40 Kb以上;

4)若提供组织样品,则植物样本需为无菌黄化苗、组培样品或嫩叶;动物样本为肌肉、血液等脂肪含量较少的组织。尽量选择同一个体取样,以减少个体差异性对后续拼接的影响。如果动物样本的性别决定模式是XY型,则尽量选择雌性个体(XX型),如果是ZW型,则尽量选择雄性个体(ZZ型)。


菠萝基因组与景天酸代谢光合作用的演化


The pineapple genome and the evolution of CAM photosynthesis


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研究背景


菠萝是世界上仅次于香蕉的主要热带水果,有85个国家生产,种植面积达100多万公顷,每年给全球带来86亿美元的直接经济价值。菠萝使用一种独特的光合作用途径,称为“景天酸代谢”(CAM),是一种利用昼夜节律的碳固定方法,本研究鉴定出菠萝基因组中所有参与景天酸代谢途径的基因,阐明了景天酸光合作用基因是通过改变调控序列演化而来,并且受昼夜节律基因的调控,是光合作用功能演化研究的重大突破。

 

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研究方案


材料:菠萝(A. bracteatus)栽培品种F153,MD12以及野生品种CB5。

建库:180bp,500bp,3kb,8kb,20kb,BAC文库

测序:PacBio RS II platform,Illumina HiSeq2000,Illumina HiSeq2500,Roche 454 FLX。

分析:基因组de novo组装,转座子分析,景天酸代谢通路进化分析,比较基因组学分析

 

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研究结果

 

菠萝物理图谱绘制和转座子分析

组装的菠萝基因组大小为382Mb,为基因组评估大小526Mb的72.6%,组装结果contig N50为126.5kb,scaffold N50为11.8 Mb。在组装的菠萝基因组中,转座子序列比例为44%,而在raw data中转座子比例为69%,表明没有组装成功的数据主要为转座子序列。其中一个转座子家族占据了基因组的15%,表明转座子是造成菠萝基因组不稳定的主要因素,从而引起高速率的体细胞突变。

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图1 基于编码菠萝逆转座酶保守域的LTR序列的系统发生树分析

 

菠萝景天酸代谢通路分析揭示CAM光合功能演化

在全基因组范围内对菠萝基因组控制景天酸代谢光合作用通路进行详细分析,鉴定了所有参与景天酸代谢途径的基因。通过分析参与景天酸代谢光合作用的基因表达的昼夜节律,发现是菠萝β碳酸脱水酶在夜间固定二氧化碳。在三个β碳酸脱水酶基因的启动子区域都存在一个顺式调控元件CAA1结合位点,该位点是结合参与昼夜节律调节的核心元件。菠萝景天酸光合作用是通过改变C3光合作用现有基因的调控元件实现的,有别于其它新性状通过新基因的获得而形成。


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图2 景天酸代谢通路进化分析

 

菠萝基因组经历两次全基因组复制事件

菠萝是单子叶植物,在进化树上与禾本科近缘(包括玉米、高粱、小麦、水稻),是禾本科作物比较基因组分析的最好的参考基因组。相比于禾本科植物的三次全基因组复制,菠萝基因组只经历两次全基因组复制,有更少的基因,更适合于研究研究基因功能和互作。菠萝染色体组成与单子叶植物的祖先形式更加相似,单子叶植物七条古老染色体得以重建,为阐明最后的共同祖先的基因含量与结构提供了一个很好的参考基因组。

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图3 菠萝25条染色体的两次全基因组复制事件


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研究结论


本研究构建了菠萝的物理图谱分析了转座子序列对菠萝基因组造成的不稳定性,景天酸代谢通路基因分析发现菠萝是通过改变C3光合作用现有基因的调控元件获得新的光合作用功能。进一步的比较基因组学分析表明菠萝的基因组只经历两次全基因组复制事件,可作为禾本科植物比较基因组学研究的理想参考基因组。

 

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参考文献


Ming R, Vanburen R, Wai C M, et al. The pineapple genome and the evolution of CAM photosynthesis[J]. Nature Genetics, 2015, 47(12): 1435-42.

Q植物基因组测序对样品取样有什么特殊要求?


A要求对黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品取样;建议采用纯合体或单倍体材料。


Q

动物基因组测序对样品取样有什么特殊要求?



A

样品提取应选用肌肉、血液等脂肪含量较少的部位,并尽量选用同一个体进行取样。如果物种体积较小,单个个体所提取的 DNA 量不足一次测序反应,在保证量的情况下,应 当尽量减少物种的个数,以减少个体差异性对后续拼接的影响。样品建议采用纯合体材料。



Q为什么要做 survey?



A通过 Survey 可以知道基因组大小、GC 含量及重复序列等情况,为后续测序、组装研究提供指导。Survey 一般建 500bp 小片段文库,测 50X,这些数据是不会浪费的,可以用于 后期组装。



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