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技术路线


细菌基因组测序是指利用二代或三代测序技术,获得细菌的基因组序列;并在全基因组组装的基础上,进行基因组组分分析,功能注释等分析,其已取代传统方法成为研究细菌进化遗传机制,关键功能基因的重要工具。


根据不同的研究目的和需求,细菌基因组测序可以细分为如下4个产品:


细菌框架图:采用小片段文库建库的方式,利用HiSeq或MiSeq进行深度测序,并进行初步的基因组组装,获得基因组序列;其性价比高,满足细菌基因组研究基本需求。


细菌精细图:采用大片段加小片段文库的方式,利用HiSeq和MiSeq进行深度测序,并进行反复优化的基因组组装,获得基因组序列;其是目前研究细菌基因组的主流产品。


细菌完成图:综合利用一代、二代、三代等测序技术,根据菌株具体情况制定最优策略,最终得到一条完整的基因组序列(1 Scaffold,0gaps),是细菌基因组测序组装的最高要求。


细菌重测序:主要是针对已知基因组序列的细菌,采用小片段文库,利用HiSeq进行深度测序,主要关注基因组遗传变异情况(包括SNP、InDel等),也可进行群体细菌进化分析和Ka/Ks分析,是群体研究的首选。


优势

细菌基因组测序优势


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技术路线


细菌基因组de novo测序技术路线


图1 细菌基因组de novo测序技术路线


细菌重测序技术路线.png


图2 细菌重测序技术路线



产品参数

细菌基因组测序产品参数

样本要求


细菌重测序样本要求.png

弥散性分歧杆菌的进化与起源


Insight into the evolution and origin of leprosy bacilli from the genome sequence of Mycobacterium lepromatosis


弥散性分歧杆菌的进化与起源

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设计思路


设计思路.png


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研究结果


M. lepromatosis M. leprae基因组比较

M. lepromatosis基因组共有3,206,741个碱基,组装共得到126个Contig,除了一个之外,其余的contig都能比对到M. leprae的参考基因组上,占总碱基数目的94%。比对不上的contig包含5个结核分歧杆菌的假基因。M. lepromatosis共含有1477个CDS和1334个假基因,与M. leprae相比,其共线性几近“完美”,有92%的基因和假基因相同。

图2 M. lepromatosis 和M. leprae基因组共线性分析

图2 M. lepromatosisM. leprae基因组共线性分析

注:红色和橙色用来区分M. lepromatosis 基因组的126个contigs;灰色的阴影用来区分个体的contig,白线条表示无blast hits,黑线表示在M. lepromatosisM. leprae之间已经确定存在结构变异。


    M. lepromatosis M. leprae基因组序列同源性分析

M. lepromatosisM. leprae基因的直系同源CDS和假基因的核苷酸序列的保守程度在功能范畴质检的差异较大,如图3所示;最保守的基因是rRNA和tRNA(置信度>95%),最不保守的是PE/PPE蛋白,显示出有选择压力的痕迹。两个物种的CDS有93%是相同的,但假基因有82%的相似度。假基因质检的序列保守性的分布较广,这或许反映出它们各自分化的时期,因为更古老的假基因不再发生分歧。


图3 M. lepromatosis 和M. leprae基因簇的核苷酸序列同源性分析

图3 M. lepromatosisM. leprae基因簇的核苷酸序列同源性分析


    基因组共线性分析致病性

为了应对铁元素的缺失,细胞内的致病菌常常从宿主组织中清除亚铁血红素或者产生、释放铁载体来捕获铁元素,例如分支杆菌素。两株麻风杆菌都含有ESX-3 gene cluster,该基因簇参与铁和锌的吸收。分支杆菌素(mbt)已经证明在M. tuberculosis的生长和毒力方面有重要作用,但是在M. lepromatosisM. leprae基因组中却丢失了。在M. tuberculosis中,hemN基因簇位于mbt基因簇的下游,与hemABCDEKLYZ一起主导亚铁血红素的合成。有意思的是,hemN基因簇在M. lepromatosis出现,而M. leprae没有,可以推断出该缺失是从MRCA分离后产生的,M. leprae可能无亚铁血红素的合成能力(图4)。值得注意的是,最不保守的PE和PPE蛋白基因家族中,有致病性分歧杆菌的特征以及ESX (type 7)蛋白分泌系统(图3)。

图4 M. lepromatosis 、M. leprae、M. tuberculosis共线性分析hemN基因


图4 M. lepromatosis 、M. leprae、M. tuberculosis共线性分析hemN基因


    M. lepromatosis的地理调查

为了对麻风杆菌的全球分布有更清晰地认识,使用不同的PCR方法和特异性引物对hemN 和RLEP进行分析,总共有227个来自病人的组织样本。分析表明M. leprae的DNA存在于221个病例中,而M. lepromatosis仅在6例存在,所有的病例都来自墨西哥。


表1 基于不同PCR方法分析的麻风杆菌地理调查

表1 基于不同PCR方法分析的麻风杆菌地理调查

M. lepromatosis来源和进化分析

通过对M. lepromatosis 、M. leprae菌的全基因组比较分析,假基因化发生在祖先时代,MRCA与其它已知的麻风杆菌比较发现其基因组是更小的,自从与MRCA分离以来,更多的假基因和删除事件出现在2个物种之间。M. lepromatosisM. leprae有更多相同的重复序列和基因组定位,但是两者的序列差异非常显著。利用M. lepromatosis 、M. leprae菌的地理来源和SNP亚型,通过MEGA6软件最大简约法进行进化树分析其进化关系,如图5所示。平均来看,M. lepra菌两两之间有90个碱基的置换,在M. lepraM. lepromatosis之间有257,518个碱基置换,M. lepromatosisM. leprae的TMRCA估计是13.9Mya。


图5 M. lepromatosis 和M. leprae的进化关系分析

图5 M. lepromatosis M. leprae的进化关系分析

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研究结论


麻风病被认为是由麻风杆菌专一性引发的感染人类的恶性疾病。2008年,Han等人提出,Mycobacterium lepromatosis——一种未纯培养新物种,可能引发一种罕见但严重的疾病——弥散性麻风结节病。通过比较基因组学,研究者们确定了两者之间具有密切的近缘关系,来自共同的祖先,经历了基因组缩减和基因衰变。由于它们在13.9Mya分离,两个物种一直在不断的发生基因缺失,但来自不同区域的基因组,M. leprae似乎更接近于现代。通过使用PCR手段,研究者发现M.lepromatosis属于稀有物种,而且患者仅限于墨西哥地区。

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参考文献


Pushpendra S, Andrej B, Schuenemann V J, et al. Insight into the evolution and origin of leprosy bacilli from the genome sequence of Mycobacterium lepromatosis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(14):4459-4464.


Q细菌基因组测序主要有哪些产品?


A

根据不同的研究目的与需求,细菌基因组测序可以细分为如下4个产品

细菌框架图采用DNA小片段(500bp)建库策略,利用MiSeq进行深度测序与初步的基因组组装,从而获得基因组序列信息,性价比高,满足细菌基因组研究基本需求。

细菌精细图采用小片段(500bp)加大片段(2Kb+5Kb)建库策略,利用HiSeqMiSeq进行深度测序与反复优化的基因组组装(Scaffold NO.50),是目前研究细菌基因组的主流产品。

细菌完成图利用三代测序技术,根据菌株具体情况制定最优策略,最终得到一条完整的基因组序列(1 Scaffold0 Gaps),是细菌基因组测序组装的最高要求。

细菌重测序针对已知基因组序列的细菌,采用小片段建库,HiSeq深度测序,后续分析不依赖于组装,关注基因组变异情况(包括SNPInDel等),是群体研究的首选。



QDNA mate-pair文库(大片段文库)的定义、用途?


A

(1)定义:首先将基因组DNA随机打断到特定大小(2-20kb);然后经末端修复,生物素标记和环化等实验步骤后,再把环化后的DNA分子打断成400-600bp的片段并通过带有链亲和霉素的磁珠将带有生物素标记的片段捕获。这些捕获的片段再经末端修饰和加上特定接头后建成大片段文库,不需要克隆到细菌中,直接在Illumina测序仪上进行测序。通过大片段文库构建,从而获得基因组中较大跨度(2-20kb)片段两端的序列。

(2)用途:DNA Mate-pair文库制备的整个过程需要5天,这种从较大跨度两端所获得的序列对基因组de novo项目的组装和基因组结构变异发掘具有非常重要的作用。


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