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混池测序是基于集群分离(Bulked Segregant Analysis,BSA)策略实现对目标性状的定位研究。在分离群体中,通过对发生性状分离的子代个体分别混成两个样本池进行测序,利用高性能计算平台和生物信息学方法,计算影响性状的候选区域以及相应的突变位置和突变类型,实现对目标性状的快速定位,加速作物育种改良。


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QTL-seq定位黄瓜RILs群体多个果实长度相关QTLs


Rapid identification of fruit length loci in cucumber (Cucumis sativus L.) 

using next-generation sequencing (NGS)-based QTL analysis


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1

研究背景


黄瓜起源于喜马拉山南麓,在印度已有超过3000年的种植历史。果实长度是一个有数量性状位点控制的重要的农艺和驯化性状,然而控制黄瓜果实长度的分子遗传机制尚不清楚。野生黄瓜果实长4cm左右,而在中国北方,黄瓜的果实长度超过25cm,欧洲的大棚黄瓜长度则在10~15cm。基于高通量测序的QTL-seq是一个非常有效的QTL定位策略,能更加高效快捷地实现QTL的精细定位。

 

2

研究思路


材料:一个中国北方的长果型品种CC3和一个美国短果型品种NC76杂交,分别用F2和F3群体进行QTL-mapping,单粒传构建一个F7高世代RILs群体用于定位调控黄瓜果实长度的QTLs,结合2013和2014年基于遗传图谱的定位结果,对QTL-seq定位的结果进行相互验证

建库:137个F7 RILs的叶片基因组DNA,500bp小片段文库

测序:Illumina HiSeq 2500,PE100;CC3:16.41X,NC26:21.04X,Long-pool:42.69X;Short-pool:34.22X

分析:SNP检测与注释,SNP_Index差异分析,候选区域定位

 

3

研究结果

群体表型鉴定

分别对2013年和2014年的F3群体的子房、不成熟果实、成熟果实进行长度测量,并做两年数据的相关性系数分析。对2015年用于QTL-seq的群体进行表型鉴定,筛选极端表型个体进行混池。


未成熟果实和成熟果实长度和子房长度的相关性系数分析.png


图1 未成熟果实和成熟果实长度和子房长度的相关性系数分析


黄瓜CC3、NC76和RILs群体的果实.png


图2 黄瓜CC3、NC76和RILs群体的果实

 

QTL-seq定位与果实长度表型相关的QTLs

分别基于两个亲本参考基因组对两个混池进行BSA分析,取两个结果的交集,定位到多个与黄瓜子房长度相关的QTL,该结果与此项研究的前期基于遗传图谱的结果一致。研究发现在RILs群体中,QTL-seq对于部分微效QTL也有一定的检测能力。


分别基于两个亲本的SNP_Index分析.png

分别基于两个亲本的SNP_Index分析.png

图3 分别基于两个亲本的SNP_Index分析

 

表1 QTL-seq定位黄瓜子房长度性状相关QTLs

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4

研究结论


结合QTL-mpping和QTL-seq可定位群体的多种性状,本研究的结果为黄瓜果实长度的分子遗传机制做了进一步的解析。

 

5

参考文献


Wei Q Z, Fu W Y, Wang Y Z, et al. Rapid identification of fruit length loci in cucumber (Cucumis sativus L.) using next-generation sequencing (NGS)-based QTL analysis[J]. Scientific Reports, 2016, 6.


 

BSA方法定位水稻耐盐性性状


MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar

 

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1

研究背景


日本海啸导致土地的盐碱化使农业生产面临巨大挑战。研究者通过对日本地方水稻品种“Hitomebore”进行EMS诱变,筛选出耐盐性突变体,通过MutMap辅助突变基因定位,仅利用2年时间就培育出水稻耐盐新品种,是基于NGS技术加快育种速度的典型运用。

 

2

研究思路


材料选择:地方品种Hitomebore进行EMS诱变得到耐盐突变体hst1;Hitomebore与hst1杂交构建F2分离群体;取20株F2分离群体中的耐盐性个体进行混池。

建库:野生型亲本Hitomebore提取DNA,单独建库。20株F2子代提取DNA后进行等量混合,构建子代DNA池再进行建库。

测序策略:HiSeq 2500测序;亲本测序深度≥20X;子代测序深度≥10X。

分析方法:群体SNP检测及注释,SNP_index差异分析,目标性状定位。

 

3

研究结果


耐盐突变体hst1筛选

通过对当地水稻品种Hitomebore进行EMS诱导筛选得到的水稻突变体hst1能在0.75%的NaCl浓度下保持青绿,抗盐能力强,适用于进一步研究。

 

全基因组BSA耐盐性状定位

将目标区域锚定在6号染色体上2.76 Mb~8.57 Mb区间,该候选区域其中1个SNP的突变使一个无义色氨酸密码子突变为终止子,所在基因为OsRR22,导致突变体hst1产生耐盐表型。

 

耐盐突变体hst1抗盐机理验证

通过进一步实验验证,证明是OsRR22基因中转座子Tos17的插入致使该基因部分功能缺失,使得突变体hst1产生耐盐表型。通过RNA-seq证明耐盐突变体hst1只影响了小部分基因的表达,所以研究者通过表型验证发现耐盐突变体hst1的产量和品质等均与其亲本无差异。


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图1 水稻耐盐性状突变基因的定位及鉴定

 

4

研究结论


针对EMS诱变材料,通过Mutmap分析方法,找到控制水稻耐盐性的候选基因OsRR22。通过实验验证,证明是OsRR22基因中转座子Tos17的插入致使该基因部分功能缺失,使得突变体hst1产生耐盐表型。本研究仅用两年时间培育出了耐盐性的水稻新品种,为快速进行作物育种提供了新思路。

 

5

参考文献


Takagi H, Tamiru M, Abe A, et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]. Nature Biotechnology, 2015, 33(5):445-449.


QQTL-seq中样本的选择和测序深度建议?


A

具有一对极端性状的两种品系个体杂交产生F1代,F1代再自交产生性状分离的F2代,选取性状差异明显的个体进行混池测序

每个混池中个体数目:20个以上;

测序深度:每个混池测20X以上,亲本15X以上。



Q混池测序的后期验证怎么进行?


A

如果检测碱基变化,PCR扩增出目标区域后,用一代测序即可。如果要进行生物功能的验证,要看老师那边具体的实验设计(基因敲除/回补)



Q混池测序中能不能在单个样品间做标记,在混池中研究个体的情况


A可以给单个样品做标记,在Index测序引物前面加上barcode, 用来区别同一个文库中的不同个体;在Index测序引物后加上Index(9个碱基的特异序列),可以区分不同的文库,此类情况属于混合建库



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