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技术简介


CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年发展起来的一种高效便捷的基因编辑技术,系统中的向导RNA是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别,但是gRNA对目标DNA的匹配有一定的容忍度,允许个别碱基的错配,可能出现脱靶现象。基于全基因组重测序,通过生物信息分析软件可以检测潜在的脱靶位点。


优势

CRISPR脱靶检测优势


CRISPR脱靶检测应用领域



技术流程


CRISPR脱靶检测技术流程


产品参数


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样本要求


CRISPR脱靶检测样本要求



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亨廷顿舞蹈症基因敲入猪模型猪模型建立


A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington's Disease


亨廷顿舞蹈症基因敲入猪模型猪模型建立

研究背景


亨廷顿舞蹈病是由单基因突变导致的神经退行性疾病,是一个理想的疾病模式。但是在以哺乳动物为模式动物模拟这种疾病研究时却处处碰壁,因此建立准确模拟病理的动物模型,成为生命科学领域亟待攻克的难题。


研究思路

材料:基因编辑F1

建库:DNA小片段文库

测序:Illumina HiSeq X ten

分析:潜在脱靶位点分析,sgRNA同源序列测序深度分析

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研究结果


人的亨廷顿舞蹈病是HTT基因第一个外显子150CAG重复导致的,研究人员通过CRISPR/Cas9编辑技术,成功将包含150CAG重复序列的人HTT基因第一个外显子精确的替换掉猪HTT内源性基因的第一个外显子。基因编辑是在成纤维细胞中实现的,筛选出阳性克隆细胞后,后通过体细胞核移植技术,成功培育出亨廷顿舞蹈病猪。


CRISPR脱靶检测 蓝色 宋+A-13  图1.jpg


对基因敲入个体的行为学研究发现,随着年龄的增大,这些个体逐渐显示了与“舞蹈”症一致的特征:步态异常、呼吸困难等。病理学观察发现,亨廷顿猪有大脑纹状体神经元死亡的典型病理特征。


该研究中基因编辑的成功实现会影响编辑区域的比对深度,因此比对深度可以作为是否成功编辑的一个参考因素。安诺基因通过全基因组重测序的方式对潜在的脱靶位点(容错3个碱基以内的sgRNA同源序列)相对测序深度进行分析,最终结果显示成功实现基因敲入个体中不存在脱靶位点。

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研究结论


本研究成功构建了世界首例可遗传的亨廷顿猪模型,对CRISPR编辑成功的亨廷顿舞蹈症猪进行全基因组重测序,通过分析未检测到脱靶位点,成功助力世界首个亨廷顿舞蹈症猪模型建立。


参考文献


Yan S, Tu Z, Liu Z, et al. A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington's Disease[J]. Cell, 2018, 173(4).



CRISPR脱靶检测 蓝色 宋+A-18  FAQ.jpg


Q怎么发现潜在的脱靶位点?


A

全基因组重测序后,通过比对找到PAM+sgRNA相似序列,标准是容错率三个碱基以内。



Q哪些样本可以做脱靶检测?


    A

基因编辑的细胞系或动植物个体都可以做脱靶检测,最好以基因编辑前的样本为对照,或者提供参考基因组。



QPCR产物可以做脱靶检测吗?


A

PCR产物也可以检测,也可以统计编辑效率。





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