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DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息,获得高度富集区域范围内C位点的甲基化水平数据,对于表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法,通过酶切富集启动子及CpG岛区域,并进行Bisulfite测序,同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点,与基因表达、表型性状息息相关。RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法,在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

 

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应用RRBS测序技术鉴定肥胖患者的基因变化[1]


Next-generation sequencing methylation profiling of subjects with obesity 

identifies novel gene changes


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设计思路


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研究结果

甲基化位点分布特征

该研究对基因区域及CpGs岛屿的甲基化位点进行分析,共发现2,586,085个甲基化位点,大部分的甲基化位点位于基因间区,且启动子区域与5'UTR区的CpGs岛屿有明显的重叠。

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                             图1 甲基化位点分布特征

启动子、3' UTR、5'UTR区域的基因表达和甲基化差异联合分析

另外,RRBS数据分析发现,在启动子区域及3'和5'UTR区的甲基化位点共710,981个,其中甲基化差异显著的位点(DMCs)共13,130个;microarray分析发现有99个基因差异表达显著。经联合分析发现,其中有12个基因的表达水平(共覆盖22个差异甲基化位点)与甲基水平呈负相关关系,其中SORBS3基因的甲基化水平增加,而基因表达下调。


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图2 DMCs、DMRs与差基因关系框架图

启动子、3'UTR、5'UTR区域的DMR分析

研究共发现有170个DMRs分布在启动子、3'UTR、5'UTR区域,与基因表达联合分析发现一个DMR位于SORBS3的5'UTR区,与基因表达负相关,其中DMR在肥胖人群中增加11.2%。

SORBS3基因验证

分别对SORBS3的2号转录本的启动子和5'UTR区域的DMR进行一代测序分析甲基化水平,结果与RRBS结果一致;另外对microarray结果进行q-PCR验证发现,肥胖人群中基因SORBS3表达下调。


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图3 SORBS3启动子区域甲基化验证结果


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图4 SORBS3基因DMR的甲基化水平验证结果


转录因子结合位点预测

通过motif分析发现在DMRs和DMCs有很多转录因子结合位点,可能与肥胖有紧密关系。


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图5 转录因子结合位点分析



3

研究结论


该研究对精瘦个体及肥胖患者的骨骼肌进行RRBS和芯片技术分别进行DNA甲基化和RNA水平进行分析,发现肥胖患者的表观基因组通过DNA甲基化发生了改变,且SORBS3基因发生了转录表达差异。


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参考文献


Day S E, Coletta R L, Kim J Y, et al. Next-generation sequencing methylation profiling of subjects with obesity identifies novel gene changes[J]. Clinical Epigenetics, 2016, 8(1): 1.

Q为什么RRBS主要应用于人和小鼠及哺乳动物?


ARRBS用MspI酶切将CpG位点富集出来进行测序,该酶的酶切位点为CˇCGˆG,因此RRBS只能检测发生于CCGG /GGCC位点的胞嘧啶甲基化修饰现象,而不能对这一位点以外的胞嘧啶甲基化修饰(如CHG、CHH)进行检测。哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’二核苷酸的胞嘧啶上,植物和酵母中许多物种的甲基化在其他位点如杨树主要在非CpG位点(CHH,CHG)。因此,RRBS主要运用于人和小鼠,和DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’二核苷酸的胞嘧啶上的哺乳动物。文章报道应用RRBS测定甲基化的物种有:人、小鼠、大鼠、羊、猪、三刺鱼。如果遇到老师想做哺乳动物的RRBS需要有个评估。


Q为什么RRBS测序用PE50会更好?


A

RRBS是利用MspI酶(酶切位点为CCGG)进行CpG富集区域(CpG岛)的DNA片段富集,再结合重亚硫酸盐处理和高通量测序进行甲基化的研究;而CpG岛主要集中在小片段上(40-200bp)。如果用PE125或PE150去测会使这些小片段测到接头序列,数据处理的时候就会被当作接头污染的情况被数据过滤掉。所以一般RRBS推荐使用PE50会更好。



QRRBS覆盖区域如何?


ARRBS可以覆盖85%以上的CpG岛和Promoter,这比例仅仅是针对数目。RRBS覆盖某个Promoter区域的5个CG位点,即算覆盖该Promoter。



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