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6mA-IP seq(6mA-immunoprecipitatoin sequencing)是一种类似MeDIP的基于免疫共沉淀的测序技术,利用特异性抗体富集6mA片段,扩增后进行高通量测序及甲基化分析。以较小的数据量,快速、高效地绘制全基因组DNA甲基化水平的图谱。


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哺乳动物胚胎干细胞的6mA修饰


DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells


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设计思路


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研究结果


6mA抑制基因表达

采用RNAseq对敲除Alkbh1的ES细胞进行转录组测序分析,结果显示550个基因表达下调,大部分下调基因为发育因子或种系特异性基因,并且这些下调基因明显集中于X染色体上。实验结果说明ES细胞中6mA增多会导致基因沉默,6mA抑制了基因表达,这与之前再其他物种中发现的6mA作用完全不同,已有研究的线虫、果蝇和衣藻中6mA会激活基因表达。


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图1 6mA抑制基因表达


6mA集中分布于LINE-1

鉴于ES细胞中6mA的抑制作用不同于以往其他物种中的发现,研究人员利用N6-mADIP-seq研究了Alkbh1基因敲除的ES细胞中6mA的差异甲基化区域(DMR)。结果显示检测到的6mA信号集中分布在基因间区域,进一步研究显示6mA甲基化主要分布在LINE,尤其是全长L1元件上。同时,研究还发现6mA在L1上的分布与其进化年龄相关,主要分布于较为年轻的L1(young full-length L1 elements)上,进而使其表达下调。


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图2 6mA的分布及与基因表达的关系


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研究结论


本研究利用PACBIO的SMRT-CHIP测序技术及6mA-IPseq揭示了小鼠胚胎干细胞中存在的6mA甲基化修饰,并研究了相关活性功能。研究发现6mA去甲基化酶Alkbh1,并发现6mA抑制了基因表达,这与之前在其他物种中发现的6mA作用完全不同。



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参考文献



Wu T P, Wang T, Seetin M G, et al. DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells[J]. Nature, 2016.

Q什么样的物种可以做6mA-IPseq?


A一般在原核生物中6mA分布比较多,真核生物分布较少。最近几年许多老师研究发现真核生物的6mA对于基因表达调控有关系。所以越来越多的人对于6mA在高等生物研究越来越热。所以有参考基因组的物种都可以做。


Q6mA-IPseq的建库流程


A

超声打断DNA、加“A”、加“PE adapter”和片段筛选,采用anti-m6A antibody进行免疫共沉淀反应, PCR扩增,构建甲基化6mA-IPseq文库。(与chip-seq不同的是,6mA-IPseq直接对DNA进行富集,而不是与蛋白交联的DNA)



Q6mA-IPseq的优势


A检测范围广:覆盖整个基因组范围的腺嘌呤甲基化区域;
性价比高:基于抗体富集的测序方法,提高数据利用率;



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