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染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipition,ChIP)是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法,ChIP与高通量测序的结合(ChIP Sequencing)可以在全基因组范围内对蛋白结合位点进行高效而准确地筛选与鉴定,广泛应用于组蛋白修饰,转录因子调控等相关领域的研究。


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综合表观遗传分析揭示与小鼠雌性生殖干细胞相关的独特表观遗传学特征


Integrative epigenomic analysis reveals unique epigenetic signatures involved in unipotency of mouse female germline stem Cells


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设计思路


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研究结果

特异性基因表达特征

与Nanog和Sox2基因在ESCs中特异性表达不同,Ifitm3/Fragilis,Ptx3和GM1673基因在FGSCs中选择性表达;另外,Akt1基因在FGSCs中高表达。


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1  基因表达散点图


FGSCs染色质标记的分布

对FGSCs进行Chip-seq分析发现,90%的H3K4me3结合位点位于启动子区域;另外发现,H3K27ac和RNA Poly II与FGSCs的转录活性相关,且主要富集在FGSCs的启动子区域;与胚胎干细胞相似,H3K27me3广泛存在于FGSCs的基因组区域。综上考虑,以上数据可以用来分析FGSCs的反式作用元件。


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图2 FGSCs增强子区域的表观分析

FGSCs和ESCs的增强子活性差异


FGSCs内的增强子分为两类“active”和“poised”,均位于启动子区域;对H3K4me1和H3K27ac共同修饰的位点进行K-均值聚类分析,共聚4类。与胚胎干细胞相比发现,与FGSCs特异增强子区域相关的基因转录活性增加,对其进行GO分析发现,主要富集于与生殖相关的表型基因term,而胚胎干细胞的特异性增强子区域相关基因主要与胚胎发育有关,而两者共有基因主要与有丝分裂相关。


DNA甲基化通过抑制体细胞的发育对雌性生殖细胞起作用


通过对胚胎干细胞、原始生殖细胞及雌性生殖细胞的甲基化基因进行聚类分析和功能注释,发现雌性生殖细胞特异性甲基化基因主要与体细胞的发育相关,且发现启动子区域的基因转录水平最低。另外大约90 %的基因启动子区域发生甲基化,同时gene body上也发生甲基化。另外,通过敲除基因Dnmt1发现,发生甲基化的与体细胞发育相关的基因及启动子区域RNA聚合酶含量少的基因表达显著上调,表明DNA甲基化对雌性生殖细胞鉴定起重要作用。

图3  DNA甲基化对于鉴定雌性生殖细胞的作用.png


图3  DNA甲基化对于鉴定雌性生殖细胞的作用


甲基化差异与雌性生殖细胞的性别维持关系


通过比较雌性生殖细胞与雄性生殖细胞的甲基化水平发现,相关系数为0.229;另外通过比较启动子区域的甲基化差异基因发现,仅有2689个相同基因,对雌性生殖细胞特异性基因进行GO分析发现,大部分与雄性性别发育关。但在DMRs上发现性别特异性的DNA甲基化模式,因此DNA甲基化是与雌性生殖干细胞的性别维持有潜在关系的。

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研究结论


本研究通过表观分析揭示了DNA甲基化通过抑制体细胞发育来对生殖细胞起重要作用,且甲基化与性别维持有潜在关系。另外,基因组表观分析和转录调控分析为研究雌性生殖细胞的调控机制提供了重要信息。


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参考文献


Zhang X L, Wu J, Wang J, et al. Integrative epigenomic analysis reveals unique epigenetic signatures involved in unipotency of mouse female germline stem cells[J]. Genome Biology, 2016, 17(1): 1.

QChIP-Seq的主要研究领域有哪些?


A

(1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰

2)检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位;

(3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系;

(4)CTCF转录因子研究。



Q哪些因素会影响 ChIP-Seq 的结果?


A

抗体的质量与特异性、实验设计、ChIP 的实验操作、DNA 片段长度范围、测序深度、测序质量等都会影响 ChIP-Seq 的结果。



Q样品制备过程中是否需要 PCR 扩增?PCR 扩增后是否会影响最后的结果?


A由于 ChIP 下来的 DNA 样品量通常非常少,所以在样品制备过程中需要经过一步 PCR 扩增,主要是为了获得足够上机反应的 DNA 量。如果提供的 DNA 样品足量,可减少 PCR 循环数或不进行 PCR 扩增。PCR 扩增有可能增加结果的偏向性。



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