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染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipition，ChIP）是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法，ChIP与高通量测序的结合（ChIP Sequencing）可以在全基因组范围内对蛋白结合位点进行高效而准确地筛选与鉴定，广泛应用于组蛋白修饰，转录因子调控等相关领域的研究。
CTCF异构体改变染色质结构，促使细胞进入程序性调亡
An alternative CTCF isoform antagonizes canonical CTCF occupancy and changes chromatin architecture to promote apoptosis
CTCF是一种参与染色质高级结构形成的重要蛋白。研究者通过分析多种人细胞系的RNA-seq数据，发现CTCF可能存在一种较短的异构体CTCF-s，并对此进行了实验证实。通过对带有生物素标签的CTCF-s和CTCF融合蛋白进行ChIP-seq，研究者发现CTCF-s在基因组的结合位点中68.8%与CTCF峰有重叠，而且CTCF-s具有较短的结合模体（motif）。
图1 CTCF-s与CTCF的转录本结构（左）和结合模体（右）的比较
CTCF的一项重要功能，是与黏连蛋白复合物的核心元件RAD21等结合，使得染色质形成环状（loops）。研究者对RAD21进行ChIP-seq，发现在CTCF-s过表达细胞中，大量RAD21结合位点信号下降。CTCF HiChIP实验也证实CTCF-s过表达导致原本存在的染色质环消失。RNA-seq显示，染色质成环的变化会进一步影响到原本启动子区存在CTCF的下游基因表达水平。
图2 CTCF-s过表达时CTCF和RAD21结合位点（左）及染色质成环数量（右）的变化
CTCF-s过表达激活IFI6表达，引发细胞凋亡
GO富集分析显示，CTCF-s结合上调的基因参与了I型干扰素信号传导和凋亡过程，CTCF-s表达会抑制增殖并启动细胞凋亡。其中的一个范例是干扰素诱导蛋白6基因（IFI6）在CTCF-s过表达细胞中上调，而敲低IFI6会有效阻断这种凋亡。
Hi-C和ChIP-seq数据显示，IFI6基因位于两个相邻TAD边界处，周围有多个会受到CTCF-s过表达影响的CTCF结合位点。3C实验显示，在CTCF-s过表达下IFI6启动子和远端增强子间发生更为频繁的相互作用，表明CTCF-s过表达通过改变IFI6周边染色质构象来激活其表达。
图3 IFI6周边TAD分布（上）、功能元件分布（中）和CTCF-s过表达时的loop变化（下）
该研究发现了一类新的CTCF可变剪接体CTCF-s，之后利用ChIP-seq为主的多种高通量测序工具和其他检测技术，系统研究CTCF-s各方面的性质，展现其与CTCF竞争性结合DNA带来的影响，发现其具有促进细胞凋亡的功能。
Hou C, Zhao H, Tanimoto K, et al. CTCF-dependent enhancer-blocking by alternative chromatin loop formation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(51): 20398-403.
| Q | ChIP-seq的主要研究领域有哪些？ |
| A | ChIP-seq的研究对象是蛋白质-DNA相互作用，主要使用领域包括以下两个方面： 1）判定染色质上哪些位置存在某种特定的组蛋白修饰； 2）对特定转录因子在染色质上的结合位点做精确定位。借助高通量测序技术，ChIP-seq可以一次性覆盖整个基因组，来获取蛋白结合的广谱信息；如果关注的只是少数区域的结合情况，则建议使用单个位点精密度更高的ChIP-qPCR。 |
| Q | ChIP-seq的推荐测序数据量是多少？是否需要设置重复？ |
| A | 一般来说，ChIP得到的DNA片段丰富度较低，大数据量测序意义不大。按照ENCODE目前标准：转录因子建议有20 M以上的可用reads；不同组蛋白标准不一，基本在20 M-45 M可用reads。 ChIP-seq的实验过程较为复杂，早期文章中往往缺少重复样本的设置。不过为了提高文章结论的可信度，目前的分析标准中通常推荐有2个以上的生物学重复；对于样本较难获得的情况，可以不设置生物学重复。 |
| Q | ChIP实验中使用的对照样本是否也需要测序？需要哪些对照？ |
| A | ChIP富集中常见的对照包括： 1）input，片段化后未经抗体富集的染色质后期去蛋白得到的DNA； 2）阳性对照，利用普通组蛋白或RNA聚合酶等阳性蛋白抗体进行免疫沉淀得到的DNA； 3）阴性对照，免疫沉淀过程中不加入抗体或者加入非特异性IgG抗体得到的DNA。 其中，input在数据分析时用于除去背景、进行检峰，是必须要进行建库测序的样本；阳性对照所用抗体与目标蛋白无关，不必进行建库测序；阴性对照理论上基本不会捕获到足量DNA，无法进行建库测序。 |