IF=14!肿瘤特异可变剪切变体经典案例分享
2019.04.11

上期小编向大家分享了全长转录组测序(iso-seq)在揭示转录组复杂性、辅助基因组注释方面的应用。除动植物研究外,近年来iso-seq在医学方面也文章频出,如研究人骨髓细胞亚群的isoform[1]、KIR受体基因的大量可变剪切[2,3]、肿瘤细胞剪切因子NOVA1[4]、乳腺癌细胞复杂基因结构[5,6]等。今天小编挑选了一篇经典医学案例来聊聊iso-seq在研究肝细胞癌HCC可变剪切变体方面的应用~的轻狂。


文献名称:长读长测序鉴定肝细胞癌的可变剪切变体和肿瘤特异性isoform[7]

发表时间:2019年1 月

发表期刊:Hepatology(IF:14.079)

样本选择:

三代iso-seq:HCC患者细胞和MIHA细胞系;

二代RNA-seq:HCC细胞、MIHA细胞系、HCC癌及癌旁组织、正常肝组织



实验设计  


流程图



实验结果  


01 可变剪切(AS)变体整体分析


研究中对8例来源于患者的HCC细胞和MIHA细胞系进行SMRT测序,共获得8,990条全长转录本,其中362条是已知位点的新isoform(图A)。与已注释isoform相比,新isoform的平均长度较短;分析发现剪切因子的异常调节与RI和SE类型AS事件的产生有关,且两种事件的发生呈负相关(图B)。对新isoform进行GO富集分析,发现它们在RNA结合、酶结合及调节、转录活性等方面显著富集(图C)。这些通路中基因的剪切变体可能通过其他机制调控HCC细胞中的癌症相关通路。


可变剪切分析[7]

可变剪切分析[7]



02 肿瘤特异性isoform分析


研究中将正常肝组织、MIHA和HCC细胞中的转录本进行对比,共获得2,057条HCC细胞特有的转录本(图A)。51.7%的基因功能在酶结合及调节、受体结合和转录调节等方面富集(图B)。与成对的癌旁组织相比,在约50%的HCC肿瘤样本中DEK和ADRM1变体的表达上调超过10倍,少数样本甚至上调超过100倍;同样地,SRSF3、ROR1和VDR变体在HCC中也有较明显的表达上调(图DE)。这些结果表明上述的AS变体表达水平或许可以暗示肝癌发展进程。

 

肿瘤特异性isoform分析[7]

肿瘤特异性isoform分析[7]



03 ARHGEF2变体的生物学和临床显著性


ARHGEF2在激活HCC的致癌RhoA信号通路中起重要的作用。为探究ARHGEF2的v1和v3变体(图A)在肝癌患者中的关联性,作者在10例正常组织、87例肿瘤及其成对的癌旁组织中对它们的表达进行了定量检测:v1和v3在正常组织中几乎不表达,而在癌旁组织中显著上调;与癌旁组织相比,肿瘤组织中v1和v3出现平均3-4倍的上调(图D),并表现出很强的线性相关性(图E)。这表明v1和v3变体在肿瘤组织中共表达,且可以暗示肝癌的早期变化。


ARHGEF2变体在HCC患者中的表达分析[7]

ARHGEF2变体在HCC患者中的表达分析[7]



之后作者将ARHGEF2变体的表达与肝细胞癌的临床病理进行相关性分析。研究发现v1和v3的高表达与微血管侵犯显著相关,昭示着肝癌的传播和转移(图A);生存分析中,v1和v3的表达量越高,对应的患者的存活率越低(图C)。此外,通过将变体表达量与肿瘤等级相关联,发现v1变体的高表达与2级和3级肿瘤也高度相关(图B)。



ARHGEF2变体的临床病理分析[7]

ARHGEF2变体的临床病理分析[7]



04 AS变体特异性生物学功能分析


为探究AS变体是否有特异的生物学功能,研究者构建了ARHGEF2敲除细胞系HKCI-8和Hep3B,并在MIHA细胞系和敲除细胞系中将v1和v3变体过表达。数据显示,虽然许多癌症相关基因会促进细胞生长,但v1和v3不具有影响细胞生存的能力。v1和v3的表达会诱导EMT(上皮向间叶细胞转化)过程的发生,使细胞获得高迁移和入侵能力,且v3的效果更显著(图BC);v1的过表达则能提高RhoA的活性,促进其信号通路在细胞运动中的作用。此外,通过分析细胞干性标志物的表达水平,作者还发现v1和v3的表达能增强细胞的肿瘤干性(图DEF)。


AS变体特异性生物学功能分析[7]

AS变体特异性生物学功能分析[7]



综上,研究中利用全长转录组测序鉴定了HCC细胞新的和特有的isoform,并对它们的表达模式和特异性生物学功能进行了分析。研究结果强调了三代测序技术在鉴定可变剪切事件上的优势,且AS变体可能作为肿瘤治疗的新biomarker或分子靶标,为HCC的治疗和预后提供有力支持。


往期回顾

PacBio Iso-seq经典研究系列(一): 深入揭示转录组复杂性


参考文献:

[1] Deslattes Mays, A., Schmidt, M., Graham, G., et al. Single-Molecule Real-Time (SMRT) full-length RNA-sequencing reveals novel and distinct mRNA isoforms in human bone marrow cell subpopulations[J]. Genes, 10(4),253. doi:10.3390/genes10040253

[2] Bruijnesteijn Jesse., van der Wiel Marit K H., de Groot Nanine., Otting Nel., et al. Extensive alternative splicing of KIR transcripts[J]. 2018, Front Immunol, 9, 2846.

[3] Bruijnesteijn, J., Van, M. D. W., Swelsen, W., et al. Human and rhesus macaque kir haplotypes defined by their transcriptomes[J].  2018, Journal of Immunology, 200(5), ji1701480.

[4] Sayed Mohammed E., Yuan Laura., Robin Jerome D., et al. NOVA1 directs PTBP1 to hTERT pre-mRNA and promotes telomerase activity in cancer cells[J]. 2018, Oncogene.

[5] Maria, N., Sara, G., Karen, N., et al. Complex rearrangements and oncogene amplifications revealed by long-read DNA and RNA sequencing of a breast cancer cell line[J]. 2018, Genome Research, gr.231100.117.

[6] Anvar, S. Y., Allard, G., Tseng, E., et al. Full-length mRNA sequencing uncovers a wide spread coupling between transcription initiation and mRNA processing[J]. 2018, Genome biology, 19(46).

[7] Chen Hui., Gao Feng., He Mian., et al. Long-read RNA sequencing identifies alternative splice variants in hepatocellular carcinoma and tumor-specific isoforms[J]. 2019, Hepatology.




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