Nature解读-马铃薯泛基因组如何验证关键性状控制基因
2022.08.24

泛基因组(Pan-genome)是一个物种内所有基因组信息的总和,它比单一参考基因组涵盖了更多的遗传多样性,在关键性状控制基因的挖掘上更准确。近年来,已有多个作物构建了完整的泛基因组。但是,定位到关键基因之后,如何验证是困扰大家的一个重要问题。


马铃薯作为世界第三大主粮作物,商业化生产多以利用种子块茎繁殖的高度杂合四倍体品种为主。近年来,以种子为基础的二倍体杂交育种已经成为绿色改革趋势,但到目前为止,对二倍体马铃薯基因组进化和多样性的研究相对较少,这限制了其多样性在马铃薯育种中的应用。


2022年6月8日,中国农业科学院深圳农业基因组研究所黄三文团队在国际学术期刊Nature(IF=49.962)发表了最新研究成果“Genome evolution and diversity of wild and cultivated potatoes”。研究人员解析了二倍体马铃薯的泛基因组,为实现泛基因组在作物育种的应用提供了新的解决方案。


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研究背景


马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上重要的非谷类粮食作物,绝大多数商业种植的品种是高度杂合的四倍体。基于真种子的二倍体杂交育种有可能给未来马铃薯育种和生产带来革命性的变化。



到目前为止,对野生和栽培地种马铃薯基因组进化和多样性的研究相对较少,这限制了其在马铃薯育种中的应用。



研究内容


1. 技术路线


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2. 主要结果



研究人员挑选了具代表性的44份二倍体马铃薯种质的基因组,包括地方栽培种、野生种,还挑选了马铃薯姊妹类群——类马铃薯组(Section Etuberosum)的两个种进行重测序、组装和注释,分析发现马铃薯与近源物种番茄、Etuberosum之间,以及马铃薯类群内部都存在广泛的种间杂交和不完全谱系分选现象,反映了马铃薯类群经历了复杂的演化历史。


利用高质量的泛基因组,研究人员发现马铃薯中抗病基因相比于番茄和Etuberosum存在明显扩张。推测原因是,无性繁殖的马铃薯相比于种子繁殖更容易受到病原菌的侵染,从而促使了抗病基因数量的扩张以应对病原菌对薯块的侵染。


通过马铃薯、番茄和Etuberosum的多组学比较分析,研究人员鉴定到一个可能在薯块发育过程中发挥关键作用的TCP转录因子。通过对二倍体马铃薯进行基因敲除实验,观察表型发现,相比于野生型,其突变体匍匐茎顶端无法正常膨大形成薯块,转而发育成了侧枝,这表明该基因在薯块发育的起始时期发挥关键作用,由此命名为薯块身份基因Identity of Tuber 1(IT1)IT1与结薯移动信号因子SP6A存在蛋白直接互作,不结薯种Etuberosum虽然有IT1却在SP6A上有突变。


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通过多组学比较分析鉴定马铃薯薯块身份基因IT1


a). 多组学手段鉴定到229个薯块发育相关候选基因。

b). IT1基因附近的保守非编码序列。tepCNS:番茄、Etuberosum、马铃薯共有的保守非编码序列得分,pCNS:马铃薯特有的保守非编码序列得分。

c). IT1在不同材料、不同组织中的表达量热图。

d). 野生型与it1敲除突变型的表型。

e). 野生型与it1突变型材料在薯块起始发育过程中的表型比较。

f). 酵母双杂验证IT1与SP6A的互作。

g). 马铃薯与Etuberosum中的SP6A蛋白结构域示意图。


3. 验证实验


3.1 构建it1突变体


本研究利用二倍体马铃薯Phureja S15-65克隆进行基因编辑。来自S15-65克隆的IT1 19个核苷酸的单导RNA序列被整合到CRISPR-Cas9载体pKSE401中。用三周大的植株进行转化。Agrobacterium介导马铃薯节间转化的方法:预培养2天后,将外植体与含有目标序列pKSE401的农杆菌在2 mg l−1 α-萘乙酸和1 mg l−1 玉米素的条件下共培养2天,然后用0.01 mg l−1 α-萘乙酸和2 mg l−1 玉米素介导愈伤组织诱导和再生,直至芽增殖。阳性转化子在含50 mg l−1 卡那霉素的培养基上生长的基础上进行筛选。


3.2 酵母双杂实验


利用S15-65匍匐茎的cDNA,使用CloneMiner II cDNA library Construction Kit构建酵母双杂交的cDNA文库。根据《Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual》,以IT1为诱饵,筛选了该文库。为了进一步验证IT1SP6A的相互作用,将IT1SP6A的CDSs分别插入pGADT7和pGBKT7载体,共转染酵母株AH109,将酵母细胞分别镀在SD/−Leu/−Trp和SD/−Leu/−Trp/−His培养基上,在30度下培养5天。


实验方法:Bio-protocol-酵母双杂交(安诺基因微信公众号后台回复“酵母双杂”获取该实验方法)


3.3 萤火虫荧光素酶互补成像分析


SP6AIT1的CDSs融合在pCAMBIA-nLUC-GW和pCAMBIA-cLUC-GW载体中。将载体转化为Agrobacterium GV3101菌株,并渗透到Nicotiana benthamiana叶片中。3 天后,对离体叶片喷洒100 mM荧光素,避光10 min。在Lumazone 1300B(Roper Bioscience)弱光冷却电荷耦合器件成像装置下对叶片进行观察。


实验方法:Bio-protocol-萤火虫荧光素酶互补成像分析(安诺基因微信公众号后台回复“荧光素酶互补”获取该实验方法)


3.4 SP6A表达量定量


马铃薯自交系E4-63和不结薯品种PG0019的种子种植在土壤中,在长日照(16小时光照,8小时黑暗)条件下培养1个月,然后将一半植株转移到短日照(8小时光照,16小时黑暗)条件下。当长日植株(通常是播种后2个月)花蕾发育时,在ZT4收获长日植株和短日植株的第4叶,研究SP6A基因的表达。


用RNAprep Pure Plant Kit(DP441)提取叶片总RNA,用PrimeScript RT Reagent Kit(RR047A)将RNA反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II (RR820A)在7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量PCR。以EF1A作为内参。


实验方法:Bio-protocol-qPCR(安诺基因微信公众号后台回复“qPCR”获取该实验方法)


3.5 R3a位点和SP6A基因座共线性分析


为了绘制R3a位点周围的共线关系,使用MCScanX(Python version)识别了两个给定物种之间的共线块。提取R3a位点周围的共线性基因,使用内部R脚本绘制。为了获得SP6A基因座的共线性图,提取不同物种的SP6A基因组序列,使用MAFFT进行比对,参数为‘--auto’。使用内部Python脚本将两个物种之间的对齐区域转移到MCScanX所需的BED格式。生成了两个物种之间的微共向图。最后使用Adobe Illustrator合并不同物种间的共线性图。


实验方法:

共线性分析-安诺云小工具(安诺基因微信公众号后台回复“云工具”获取该实验方法)


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共线性分析-GenomeSyn(安诺基因微信公众号后台回复“共线性分析”获取该实验方法)


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想要实验的具体操作方法,可以在安诺基因微信公众号聊天框区域回复感兴趣的实验方法后对应的信息词,如“qPCR”、“云工具”等,即可获取对应的实验方法链接。


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