5-6分的Iso-seq怎么做|三代全长转录组在植物逆境胁迫响应中的应用
2022.06.22

逆境胁迫是影响植物正常生长发育的重要因素,探索植物应答逆境胁迫的分子机制是育种者长期研究的重要课题。在逆境胁迫下,植物体内可变剪接(Alternative splicing,AS)事件发生频率增加,部分可变剪切事件会导致功能性蛋白质翻译受阻,从而改变植物对胁迫的敏感性。胁迫同样可以引起可变多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)变化,非生物胁迫处理会引起大量基因转录本中 poly(A) 位点选择的变化,从而导致从功能性转录物和翻译产物转变为非功能性转录物。


全长转录组作为功能基因组学的一个重要方面和全新的研究领域,凭借超长读长的优势,可轻松获取全长转录本序列,实现对AS和APA的精确鉴定和分析,有助于全面深入的了解植物对环境胁迫的应答机理。接下来就结合具体的例子看一下全长转录组在探索植物胁迫机制中的应用~



Full-Length Transcriptome Assembly of Italian Ryegrass Root Integrated with RNA-Seq to Identify Genes in Response to Plant Cadmium Stress


基于RNA-Seq整合意大利黑麦草根全长转录组组装鉴定响应植物镉胁迫的基因


期刊International Journal of Molecular Sciences


影响因子:5.923


技术策略:三代全长转录组、二代转录组


取样策略:选取对照和镉处理6H后的植物幼苗总RNA进行RNA-seq;3个对照和3个处理总RNA混合构建1-4和3-10kb的Iso-seq文库


研究内容:本研究构建了意大利黑麦草根高质量的全长转录组数据库,并鉴定到镉胁迫下2367个差异表达基因,GO和KEGG富集分析初步阐明意大利黑麦草镉胁迫响应的分子调控机制。利用三代全长转录组数据对同源四倍体意大利黑麦草中的可变剪切事件进行准确表征,结果显示镉胁迫下内含子滞留事件频率增加,这与常规植物应对逆境胁迫的可变剪切响应机制相一致。该研究结果提高了镉胁迫下意大利黑麦草遗传多样性和复杂性的认识有助于后续分子育种工作的开展。


亮点解析:三代全长转录组优势使得即使没有参考基因组,也可以通过结合二代转录组测序的手段构建高质量的参考转录组,在整个转录组规模上揭示可变剪接(AS)的复杂性,进而探索植物响应胁迫的分子机理。

 

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图1 全长参考转录组的功能注释

 

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图2 利用ISO-seq对多花黑麦草全长转录组进行可变剪接(AS)分析



The Full-Length Transcriptome of Spartina alterniflora Reveals the Complexity of High Salt Tolerance in Monocotyledonous Halophyte


互花米草全长转录组分析揭示了单子叶盐生植物高耐盐性的复杂调控机理


期刊Plant and Cell Physiology


影响因子:4.927


技术策略:三代全长转录组、二代转录组


取样策略:不同盐浓度(0、350、500和800 mM NaCl)下生长的整株互花米草幼苗进行Iso-seq和RNA-seq测序 


研究内容:本研究通过将二代、三代转录测序技术结合,深入探究了互花米草的高耐盐性机制,揭示了蛋白激酶在高耐盐调控网络中的关键作用。高盐胁迫对互花米草的胁迫反应、蛋白质修饰和氧化还原相关基因的表达有较强的诱导作用,但对碳水化合物代谢相关基因的表达有较强的抑制作用。高盐胁迫提高了互花米草中可变剪切事件的发生频率,与光合作用相关的差异表达选择性剪接事件在互花米草中比例较高,与盐胁迫程度呈现相关性,内含子保留是最主要的可变剪切类型(56%)。同时,三代全长转录组也准确鉴定到高盐胁迫相关转录因子、非编码RNA等完整的转录本信息。该研究结果为盐生植物的高耐盐性调控机制提供了新见解。


亮点解析:结合三代全长转录组,通过比较转录组学揭示互花米草特异转录本,识别出耐盐调控网络中的枢纽基因,为互花米草的耐盐机理提供初步的认识。

 

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图3 互花米草全长转录组的特征


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图4 互花米草中的选择性剪接(AS)和高盐胁迫相关的可变剪切



Abiotic Stresses Modulate Landscape of Poplar Transcriptome via Alternative Splicing, Differential Intron Retention, and Isoform Ratio Switching


非生物胁迫通过选择性剪接、差异内含子保留和亚型比例转换来调节杨树转录组的景观


期刊Frontiers in Plant Science


影响因子:5.753


技术策略:三代全长转录组、二代转录组


取样策略:获取对照和包含热、冷、干旱和盐胁迫的杨树幼苗的叶片、根系、木质部的总RNA,每个样本的cDNA进行RNA-seq和4个部分(1-2、2-3、3-6和5-10Kbp)的Iso-seq。


研究内容:该研究采取了2+3联合分析的策略,通过Iso-seq直接获得差异isoform的完整序列,与RNA-seq结果相互验证,对可变剪切在杨树(Populus trichocarpa)逆境响应中的重要作用进行了深入挖掘。可变剪切的分析结果显示,非生物胁迫会扰乱了转录本的isoform,并触发广泛的内含子保留(IR)事件。差异内含子保留(differential intron retention, DIR)是杨树中普遍存在的组织和/或胁迫特异性现象并占主导地位,比例高达45%。许多参与植物发育、细胞壁代谢、昼夜节律及应激反应的基因均受到DIR的调控。在不同的逆境胁迫下,这类内含子表现出协同性的保留上调或下调。该研究表明,胁迫处理可能与完全剪接和内含子保留isoform之间的协同性上调或下调有关,并可能通过调节转录本以适应非生物胁迫中发挥重要作用。


亮点解析:RNA-seq和Iso-seq数据集的分析产生了数千种新的蛋白质编码和非编码基因模型,包括那些编码应激和/或组织特异性转录本的模型以揭示胁迫调节的可变剪切程度。


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图5 可变剪切(AS)事件的主要类别


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图6 杨树在逆境胁迫下发生的差异性内含子保留(DIR)调控



看了以上案例分析,在植物胁迫方面,三代全长转录组+二代转录组的研究套路,您清楚了吗?不着急,小编已经梳理好了思路,看下图。


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