三代人重测序应用--解析肿瘤复杂结构变异及致病机理
2022.05.31

上期小编整理了三代人重测序在人类神经系统类疾病领域的应用场景,本期我们将通过2篇安诺的项目文章来解析三代人重测序在肿瘤研究中的应用。

肿瘤是一种多基因参与调控的复杂疾病,肿瘤的发生发展必然伴随着不同类型及程度的基因组变异,分析肿瘤基因组序列和结构变异是理解肿瘤生物学的第一要务。基于三代测序对肿瘤样本鉴定到的变异信息进行系统分析,可绘制肿瘤全基因组范围内变异图谱,解析肿瘤发生发展过程中动态机理。


项目文章1:三代多组学解析胰腺癌中结构变异与三维基因组的动态互作


文章名称:Dynamic Interplay between Structural Variations and 3D Genome Organization in Pancreatic Cancer

发表期刊:Advanced_Science(IF: 16.806)

发表时间:2022年5月

合作单位:中国医学科学院肿瘤医院

 

材料选择


Case:两株源自人胰腺导管上皮的胰腺癌细胞系(PANC1和 BxPC3)

Control:永生化正常上皮细胞系(HPDE6C7)


测序策略


三代SMRT长读长测序技术


测序策略1.png


染色质空间构象捕获技术(Hi-C)

转录组测序(RNA-seq)

 

研究思路


研究思路.png

研究结果


研究者首先利用三代测序分别对PANC1、BxPC3和HPDE6C7进行变异检测,全面分析了胰腺导管上皮细胞恶性转化过程中SVs。通过检测分别在PANC1、BxPC3和HPDE6C7中发现20805、21168和23035个SV,其中共有 SVs(2874个)仅占总数的13%。研究表明胰腺癌中SVs具有多态性和细胞特异性,并且SV的特异性增加了基因组的不稳定性。

 

为了进一步揭示SVs对三维染色质结构和基因表达的影响,研究者应用Hi-C及转录组测序技术,对3株细胞系的染色体空间构象从在区室(A/B compartment)、结构域(contact domain,CD)和染色质环(loop)三种不同尺度上进行了全面分析。分析发现癌症特异性SVs可通过破坏结构域边界(contact domain boundary,CDB)改变染色质的空间构象,影响相关基因表达的调控。


图1.png


图1 CDKN2A、SMAD4纯合子缺失对三维基因组结构和基因表达的影响

 

研究者还发现跨CDB的SV可能导致TAD发生融合的现象,PANC1中的跨CDB的缺失变异引起抑癌基因CDKN2A的缺失,导致两端TAD发生融合。进一步通过TCGA数据库的8359例泛癌组织样本数据分析,发现90%的CDKN2A失活与其相邻基因MIR31HG表达上调相关,这可能是缺失变异导致附近基因组区域异常扩增和TAD融合。此外,研究者发现胰腺导管腺癌中驱动基因SMAD4的缺失与复杂的染色体重排有关,并基于Hi-C辅助组装的相关原理等揭示了其对三维染色质结构的影响。

 

项目文章2:利用三代PacBio测序检测PLC/PRF/5细胞系及基因编辑清除HBV的整合

 

文章名称:Pacbio Sequencing of PLC/PRF/5 Cell Line and Clearance of HBV Integration Through CRISPR/Cas-9 Syste

发表期刊:Frontiers in Molecular Biosciences(IF: 5.246)

发表时间:2021年8月

合作单位:北京大学医学部


材料选择


人肝癌亚历山大(PLC/PRF/5)细胞系

 

测序策略


三代SMRT长读长测序技术


三代2.png


研究思路


研究思路2.png

 研究结果


研究者首先利用三代SMRT平台对PLC/PRF/5细胞系进行测序,利用Canu软件进行测序数据纠错。通过BLAST将这些片段定位到HBV基因组上,并提取含有HBV的reads片段。最后利用TSD软件分析HBV整合位点,将含HBV片段与人类参考基因组比对,在PLC/PRF/5中获得了84个HBV-人类基因组整合位点,位于7条染色体上。

 

乙肝病毒的整合通常会导致基因组不稳定,研究者发现在chr3和chr16中,HBV整合位点附近分别观察到约1400bp和12bp的人类基因组片段缺失;在chr4中观察到大规模的基因组扩增。此外,研究者还观察到病毒基因组重排,包括缺失、反转和重复(图2)。上述结果表明,整合位点附近的人类基因组和HBV基因组存在大量结构变异,HBV的整合增加了HBV整合片段和邻近人类基因组的基因组不稳定性。


图2.png


图2 PLC/PRF/5中HBV 整合模式图

 

最后研究者通过对可能表达 HBsAg的HBV 整合片段进行分析,筛选出3种以整合片段为靶点的sgRNAs组合,利用CRISPR/cas9系统敲除整合基因组中的s基因。研究者发现sgRNA联合应用可以显著降低PLC/PRF/5细胞上清液中HBsAg的水平,同时促进细胞增殖。


总结


本期介绍的2篇肿瘤应用研究案例,研究者均以三代测序技术为切入点,全面解析基因组中变异图谱,再结合多组学策略(三代基因组+转录组+表观基因组)或前沿技术来深入进行肿瘤机理研究。这种研究策略以成为肿瘤解析肿瘤发生发展、分子分型、生物标志物、预后判断等方面的研究重要新型方法。其中,项目文章1中应用了安诺优达生信分析团队自主开发的多组学可视化软件Annoroad-OMIC-Viz(https://github.com/Spartanzhao/Annoroad-OMIC-Viz)。

 

项目文章中使用的三代测序策略均为CLR模式,CLR测序优势在于超长读长,但变异检测的准确性相对较低。目前三代HiFi测序兼顾长读长和高准确度的特性已成为大片段变异检测的不二选择,安诺基因三代HiFi测序单cell平均产出超过470G,最高可达625G,CCS平均数据量达到29G!欢迎有研究方案设计需求和三代建库测序意向的老师咨询驻地销售经理。

 

作为国内基因组行业平台型企业,安诺基因拥有多样化的测序服务平台和专业的生物信息分析团队,为您科研配备三代PacBio(4台Sequel IIe+7台Sequel II)等系列仪器设备,提供从建库测序到方案设计的完整科研方案。安诺基因已与中国农业大学、中科院遗传与发育所、中国海洋大学、中国农业科学院、福建农林大学等多家科研院所开展了深度合作,助力基因组文章发表于Cell、Nature、Nature Genetics、Nature Plants等多个国际高水平期刊。