轻松get长链非编码RNA常规研究套路~
2020.08.21

自古套路得人心,那该如何进行一个严谨而有意义的长链非编码RNA研究,并且成功吸引审稿人的注意呢?有没有什么套路可循?答案当然有,今天就让小编细细道来。

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图1 lncRNA的众多功能


长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt的RNA,不编码蛋白,只编码一些短肽,可以参与调控表观遗传、转录干扰、核内运输等众多生物学进程,在生物体中作用范围广泛,作用机制多样,所以一直以来都是研究人员所关注的研究热点。近十年来,与lncRNA相关的国家自然科学基金资助金额和相关文献产出一直处于一个稳步上升的态势。


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图2 lncRNA相关的近十年国自然基金项目统计



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图3:PubMed中所收录的近十年lncRNA相关文献(截止到2020年8月)


通过整理众多前人相关研究文献,小编将一个完整的lncRNA研究总结为以下四步:差异lncRNA筛选、lncRNA的表达和定位、lncRNA的功能研究、lncRNA的作用机制探究。以下是小编整理的针对这4步的相关问答,赶紧康康~

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1. 如何挑选感兴趣的lncRNA作为后续研究对象?


目前,我们可以通过转录组芯片、高通量测序等常规技术获得处理组和对照组中差异表达的lncRNA信息,也可借助一些公共数据库对感兴趣的差异lncRNA进行查找和筛选。基于高通量测序结果的lncRNA筛选原则可以总结为以下五点:


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2. 如何对lncRNA的功能进行研究?


可将某一lncRNA功能的研究思路总结为两个方向:功能获得性研究和功能缺失研究。

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图4 RNAi(上左)、CRISPRi(上右)、CAS9-KO(下)技术原理示意图[3-6]


3. 如何对lncRNA的作用机制进行探究?


可从调控机制和亚细胞定位两个角度对某个lncRNA的作用机制进行探究。


调控机制



lncRNA对于靶基因的调控机制可以分为顺式和反式作用调控两类,顺式调控主要依赖lncRNA与靶基因位置的相关性。对候选lncRNA进行敲降,分析lncRNA附近基因的表达,若表达出现差异,则说明该lncRNA为顺式调控,反之则为反式调控[2]


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图5 lncRNA的顺式调控和反式调控机制

亚细胞定位



lncRNA在细胞内的定位在一定程度上反应其功能。如果筛选到的lncRNA定位于细胞核内,可考虑lncRNA参与mRNA的转录中调控,进而从顺式和反式作用调控的角度来探究其功能。如果定位于胞浆中,我们可以考虑和lncRNA有结合作用的物质:和 RNA有结合作用,可以从ceRNA作用机制角度考虑;和蛋白有结合作用,可以考虑mRNA可变剪切、稳定性,调节基因翻译以及蛋白修饰等机制。


4. 机制探究中常用的实验方法有哪些?


lncRNA与其他物质结合形成的复合物可以参与调控一系列生物学进程,通过RNA pull-down、ChIRP、RIP、ChIP-seq等技术可研究候选lncRNA的作用机制。


正所谓光说不练假把式,接下来就让咱们通过一篇高分文献来强化此套路的应用。



胃癌组织中上调的lncRNA——GMAN与胃癌转移相关,并通过竞争性结合GMAN-AS促进Ephrin A1的翻译[1]


文献:Long Noncoding RNA GMAN, Up-regulated in Gastric Cancer Tissues, is Associated with Metastasis in Patients and Promotes Translation of Ephrin A1 by Competitively Binding GMAN-AS

发表时间:2019

发表期刊:Gastroenterology

影响因子:17.373


主要内容


lncRNA筛选



通过转录组芯片技术对于胃癌组织和癌旁组织中差异表达的lncRNA进行筛选,然后使用RT-qPCR技术进行扩大验证,最终确定GMAN作为后续研究对象。


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差异lncRNA的筛选


lncRNA的表达和定位



使用5’和3’RACE方法对GMAN的全长进行扩增, RNA-FISH方法对其进行定位。


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GMAN在细胞中的定位(左),GMAN在基因组中的位置信息(右)


lncRNA的功能研究



敲除BCG-823 和MKN45细胞系中的GAMN基因,将细胞注射到裸鼠中并进行表型观察。


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GMAN的敲除降低了细胞系在小鼠内形成和肺转移能力


lncRNA的作用机制探究



RNA pull-down实验结果显示GMAN-ASGMAN有结合作用, GMAN-AS和ephrin A1的mRNA有结合作用。综上GMAN能够直接阻止GMAN- AS和ephrin A1 mRNA的结合作用,激活EFNA1蛋白的表达,进而促进肿瘤细胞的转移。


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GMAN调节ephrin A1的翻译和胃癌肿瘤细胞的转移


以上是小编今天的干货内容分享,有套路总结,有案例分享,正在研究lncRNA 的你是不是心动啦,心动赶紧行动吧~


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参考文献

[1] Wei Zhuo,Yiman Liu,Shuang Li et al. Long Noncoding RNA GMAN, Up-regulated in Gastric Cancer Tissues, is Associated with Metastasis in Patients and Promotes Translation of Ephrin A1 by Competitively BindingGMAN-AS[J]. Gastroenterology,2019 Feb;156(3):676-691.e11.

[2] Florian Kopp, Joshua T Mendell. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs[J]. Cell, 2018 Jan 25;172(3):393-407.

[3] Michael Boettcher, Michael T McManus. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR[J]. Molecular cell, 2015 May 21;58(4):575-85.

[4] Isabel X Wang, Christopher Grunseich, Jennifer Fox et al. Human proteins that interact with RNA/DNA hybrids[J]. Genome research, 2018 Sep;28(9):1405-1414.

[5] Suzuki H I , Spengler R M , Grigelioniene G , et al. Deconvolution of seed and RNA-binding protein crosstalk in RNAi-based functional genomics[J]. Nature Genetics, 2018 May;50(5):657-661.

[6] Luke A Gilbert , Matthew H Larson , Leonardo Morsut , et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J].Cell , 2013 Jul 18;154(2):442-51.