课代表来了!全长转录组医学方向经典应用攻略请收好~
2020.07.30

基于PacBio的全长转录组测序(Iso-Seq)无需拼接组装即可获得完整RNA分子的全长序列。目前,越来越多的研究开始利用Iso-Seq来关注解决医学方向热点问题,例如癌症或者肿瘤的转录调控机制、转录本复杂结构、差异可变剪切、融合基因等。小编汇总了近几年的全长转录组医学热门研究方向和经典文献,各位小伙伴快来抄作业吧~


获得病变组织/细胞的全长转录组

CaMKII-δ9 promotes cardiomyopathy through disrupting UBE2T-dependent DNA repair[1]

RNA-Seq由于短读长和拼接错误等局限,无法提供单个RNA分子从5'到3' poly(A)尾的全貌,因此不能精细还原全部转录本。研究人员利用PacBio全长转录组测序和绝对定量质谱技术成功描绘了介导心肌细胞死亡的CaMKII-δ基因转录本全貌。研究发现CaMKII-δ9是人类心脏中最丰富的CaMKII-δ剪接异构体,它通过靶向泛素偶联酶E2T(UBE2T)磷酸化和降解来干扰心肌细胞基因组的完整性,导致细胞凋亡和严重的心脏疾病。文章确定了CaMKII-δ9在心脏组织中的主导地位,刷新了以往对CaMKII-δ2/δ3占主要地位的认知,同时表明了CaMKII-δ9—UBE2T—DNA损伤通路可作为心肌病和心力衰竭的重要治疗靶点。

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图1 CaMKII-δ基因转录本全貌和CaMKII-δ9—UBE2T—DNA损伤通路


鉴定肿瘤/疾病中的特异性Isoform

Long-Read RNA Sequencing Identifies Alternative Splice Variants in Hepatocellular Carcinoma and Tumor-Specific Isoforms[2]


异常剪切形成的可变剪切异构体和肿瘤特异性isoform在癌症发生过程中是常见的,其可导致抑癌基因失活或者激活原癌基因,从而诱发肿瘤信号转导通路。因此,mRNA剪切的失调与肿瘤细胞增殖,侵袭和转移及癌细胞的干性密切相关。研究人员结合PacBio Iso-SeqIllumina测序获得了Hepatocellular Carcinoma(HCC剪切异构体的全貌并通过对比正常肝组织、MIHA细胞系和HCC细胞,鉴定出2,057HCC细胞特有的转录本。其中DEK、ADRM1、SRSF3、ROR1和VDR在肿瘤中显著上调。随后对它们的表达模式和特异性生物学功能进行了分析,为HCC的研究及其肿瘤特征提供了新的见解

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图2 肿瘤特异性isoform分析


药物响应研究 

Epigenetic therapy of myelodysplastic syndromes connects to cellular differentiation independently of endogenous retroelement derepression[3]

骨髓造血干细胞(HSCs)分化和异常表观抑制可介导骨髓增生异常综合征(MDS)与急性髓系白血病(AML)。研究人员推测反转座子(ERE)的诱导作用可能是逆转表观抑制药物5-azacytidine(5-AZA)在半数患者中改善造血功能的原因。作者利用RNA-Seq比较了5-AZA治疗前后MDS和慢性粒单核细胞白血病(CMML)患者骨髓HSCs中EREs转录本的表达水平,结果表明ERE的转录诱导作用并不是5-AZA 治疗成功的原因。相反,利用全长转录组等手段揭示了治疗前基因表达特点,并从发育调控基因中选取了一些具有剪切变体的转录本,用来预测5-AZA治疗对MDSCMML患者的疗效,进一步筛选了新的候选基因

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图3 发育异常HSC细胞的全长转录本分析


基因变异与疾病耐药性的相关分析

Unveiling novel targets of paclitaxel resistance by single molecule long-read RNA sequencing in breast cancer[4]

癌症特异性可变剪切(AS)事件的表达与癌症生存率相关且可能在肿瘤转移和耐药性中发挥关键作用。利用PacBio Iso-SeqRNA-Seq,作者探究了野生型和紫杉醇耐药型三阴乳腺癌细胞中发生的可变剪切事件,及耐药性发展过程中的新isoform。结果发现在所有获得的AS事件中,仅11.11%在参考基因组中已注释,表明在三阴乳腺癌耐药性发展过程中有大量AS事件产生。对BAK1的验证分析表明其在基因水平的表达无明显差异,而在转录本水平,新isoform PB.4024.2在耐药型细胞中呈3倍显著下调。BAK1的转录本模型显示内含子保留可能是引起isoform出现差异分化的原因。因此,BAK1可作为三阴乳腺癌潜在的耐药biomarker,为研究癌症的耐药性提供新思路

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图4 紫杉醇耐药型潜在biomarker分析


发现复杂疾病中的基因结构变异和融合基因

Complex rearrangements and oncogene amplifications revealed by long-read DNA and RNA sequencing of a breast cancer cell line[5]

结构变异对癌症发展尤为重要,因为它们可以产生融合基因,或者引起其他重要变化从而影响癌症基因组的进化。SK-BR-3细胞系是研究HER2+乳腺癌最重要的模型之一。作者利用PacBio单分子测序技术对SK-BR-3进行测序,绘制出癌症中结构变异的综合图谱。该图谱中存在近20,000个变异,其中大部分都被短读长测序所遗漏。在重要的ERBB2癌基因周围发现了一个复杂的嵌套重复和易位序列。全长转录组测序进一步揭示了嵌套基因组变异内的几个新融合基因,包括一些融合三个独立染色体区域的融合体KLHDC2-SNTB1因此,长读长测序是研究基因组和转录组水平上结构变异复杂性的重要手段。


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图5 融合基因分析


除了上述经典应用方向,借助全长转录组研究疾病可变剪切因子,辅助完善基因组注释,探究疾病癌症的复杂发生机制和驱动基因的结构变异,筛选疾病关键候选基因等方面也是文章频发,全长转录组已成为医学疾病研究中最强有力的辅助工具

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全长转录组医学方向经典文章列表


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自推出三代测序以来,安诺基因先后引入了10台PacBio Sequel和7台PacBio Sequel II,打造了领先的三代测序平台,日均产出数据量超2 Tb,产品服务类型涵盖了基因组组装、人重测序、动植物重测序、全长转录组等多种三代测序产品,累计项目经验800+。高质量的测序数据、快速的分析周期,安诺优达一直秉承客户至上的服务理念,为合作伙伴提供更快速、更优质的三代测序服务,期待您的垂询~


参考文献:

1. Zhang M, Gao H, Liu D, et al. CaMKII-δ9 promotes cardiomyopathy through disrupting UBE2T-dependent DNA repair[J]. Nat Cell Biol, 2019,21(9):1152-1163.

2. Chen H, Gao F, He M, et al.  Long-read RNA sequencing identifies alternative splice variants in hepatocellular carcinoma and tumor-specific isoforms[J]. Hepatology, 2019,70(3):1011-1025.

3. Kazachenka A, Young G R, Attig J, et al. Epigenetic therapy of myelodysplastic syndromes connects to cellular differentiation independently of endogenous retroelement derepression[J]. Genome Med, 2019,11(1):86.

4. Lian B, Hu X, Shao Z M. Unveiling novel targets of paclitaxel resistance by single molecule long-read RNA sequencing in breast cancer[J]. Sci Rep, 2019,9(1):6032.

5. Nattestad M, Goodwin S, Ng K, et al. Complex rearrangements and oncogene amplifications revealed by long-read DNA and RNA sequencing of a breast cancer cell line[J]. Genome Res, 2018,28(8):1126-1135.