安诺辣椒全长转录组文章热辣来袭!
2019.08.16

天然反义转录本(NAT)通常指天然情况下生物体内生成的反义RNAs,它们可以与有义转录本形成dsRNA,调节有义链的表达。因对基因组注释水平要求较高,此前植物NAT的研究主要集中在模式植物上,尚缺少对茄科植物的报道。日前,华中农大与湖南省农科院联合在The Plant Journal(IF=5.775)上在线发表文章,研究辣椒发育和逆境反应中广泛存在的NAT基因,安诺基因在本次研究中承担了全长转录组测序的工作。


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样本选择:不同处理、不同生长时期的辣椒组织。


测序策略:构建1-2 kb、2-3 kb、3-6 kb 3个不同片段大小的iso-seq文库,共测序6个SMRT cells。


实验设计

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主要结果

PacBio测序构建辣椒全长转录组

研究中通过PacBio Iso-seq测序,共获得了57,962条高质量全长转录本,其中48,785条转录本能够比对到参考基因组“Zunla”上的18,368个基因。在新发现的转录本中,有3,887条来自于1,237个新基因的可变剪切事件,另外4,532条产生于新基因的组成型剪切(图A)。全长转录组测序的优势之一是可以获得mRNA的完整UTR区域,对与参考基因组拥有相同CDS区域的全长转录本进行分析,新测得的5’和3’UTR分别最高可达100 nt和250 nt,远远高于参考基因组的平均50 nt(图DE),这表示全长转录组测序可以捕获更多完整的基因结构。


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辣椒全长转录本分析图[1]

基因模型修正

此前辣椒的基因注释主要基于短读长测序,对低表达基因外显子的覆盖度不够,导致一些基因模型的构建呈片段化。本研究中利用PacBio测序修正了近500个注释错误,使片段化的基因模型趋于完整,被修正的模型多数含有较多的外显子或较长的内含子区域(图AB),如新基因模型Capana00g004522.3可编码完整的DNA拓扑异构酶6 subunit B(1-673aa),但旧模型中是由两段基因分别编码部分多肽,且中间被一段43 kb的内含子相隔。

作者随机选取了26个新的基因模型,其中21个通过RT-PCR得到了验证(图C)。随后作者将更新后的基因注释文件,共包含41,105个基因模型的信息上传至PepperHub (http://pepperhub.hzau.edu.cn/pegnm/),并开放访问。

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片段化基因模型修正图[1]


辣椒NAT基因鉴定与表达分析

研究中通过全长转录组测序共获得2,057个cis-NAT,仅1,163个是已注释转录本。基于转录方向和重叠方式,这些cis-NAT可分为头对头、尾对尾和完全重叠三种类型,前两类大多数含有外显子重叠区域,而第三类中不含外显子重叠区域的cis-NAT占比更多,主要源于长内含子的存在(图A)。在对trans-NAT的分析中(图B),共鉴定到5,880个基因的34,193个trans-NAT。


一条转录本可以与很多其他转录本形成trans-NAT,研究人员将它们按照序列互补性分成了635组(图C)。这些基因中55.1%的互补序列都来源于转座子,而拟南芥中36.5%的trans-NAT互补序列从转座子中获取。通过对小RNA进行富集分析,发现由小RNA介导的调控机制可能对NAT基因的表达产生较大的影响。

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NAT基因鉴定与表达分析图[1]

cis-NAT与trans-NAT功能分析

通过分析NAT的表达模式,发现27个cis-NAT和81个trans-NAT subgroup参与辣椒的多种生物过程。如由Capana02g003489 基因(cis-NAT)编码的FDH1涉及水杨酸信号传导和R基因介导的抗病性;辣椒果皮发育中,trans-NAT subgroup 1 的1-3号基因下调而4-11号基因发生上调(图AB);subgroup2和3涉及与温度有关的调控功能,而subgroup4中的很多基因涉及辣椒种子的发育(图C)。

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cis-NAT与trans-NAT功能分析图[1]

cis-NAT进化分析

为研究cis-NAT的进化历程,研究人员对拟南芥(ATH)、烟草(NTA)、辣椒(CAN)、马铃薯(STU)和番茄(SLY)进行了比较分析并构建了系统进化树(图A),发现在进化中cis-NAT的丢失主要源于基因间区序列的增加(图B),而新cis-NAT的形成主要源于转座子的插入(图CD)。

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cis-NAT进化机制分析图[1]


文章亮点

本次研究利用全长转录组测序提高了辣椒基因组的注释水平,重点是完成了对UTR的精准注释。研究者在基因组范围内进行茄科植物的cis-NAT特点及进化分析,发现转座子可能参与新的cis-NAT形成。进一步的功能分析结果暗示NAT参与辣椒多种生物学过程,可能在辣椒素的合成中发挥重要功能。本文为研究辣椒的功能基因组学提供了新思路。


参考文献

[1] Wang Jubin, Deng Yingtian, Zhou Yingjia, Liu Dan, Yu Huiyang, Zhou Yuhong, Lv Junheng, Ou Lijun, Li Xuefeng, Ma Yanqing, Dai Xiongze, Liu Feng, Zou Xuexiao, Ouyang Bo, Li Feng, (2019). Full-length mRNA sequencing and gene expression profiling reveal broad involvement of natural antisense transcript gene pairs in pepper development and response to stresses., Plant J., undefined.


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