超实用文库评估知识,“青铜玩家”勿点!
2019.07.11

说起文库,可能有许多小伙伴对于文库制备流程的印象是“片段化-补平-A-加接头”,此流程看似简单,可总有那么几个“影响因素”,会成为获得高质量测序结果中最骇人听闻的“坑”。这次就带小伙伴们见识一下其中的三个“坑”:文库片段、文库浓度和文库碱基多样性。这三种“坑”对测序结果的影响究竟在哪里?该如何避免?现在就为大家揭晓~


文库片段大小


文库片段大小可通过微流控芯片技术进行检测,如Agilent 2100 BioanalyzerLabChip Touch。当实测片段大小与预测片段大小偏差<10%,且二聚体浓度小于一定比例时,即认为文库片段大小合格。文库中除了目的片段外,有可能还会出现二聚体、小片段、大片段污染等问题,这些非目的片段的存在,除了会导致文库定量不准外,还可能会造成数据产出及质量下降。下面请看详细报道:


二聚体污染


二聚体包括两种:引物二聚体和接头二聚体。一般引物二聚体的长度在100 bp以下,接头二聚体的长度在125 bp左右。二聚体会与FC结合,可通过桥式PCR形成簇,并降低有效数据的产量。同时二聚体是固定序列,会导致碱基复杂度下降,从而影响测序质量。


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为保证测序数据的产出及质量,可通过减少引物使用量、连接反应前稀释接头,及文库纯化时纯化磁珠比例调整来降低二聚体的浓度。


小片段污染


在文库的峰图结构中,除了主峰外还存在其他小片段的峰。这种情况可能是由于片段打断的条件不合适或者文库未纯化干净。小片段的存在会给文库定量带来误差,影响文库产出;此外,小片段的优势扩增还会导致同一条lane其它文库产出偏低,接头污染reads增多,影响有效数据比例。


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大片段污染


在峰图结构中除了主峰外还有大片段的峰,这种情况可能是由于片段打断的条件不合适而导致打断片段偏大。这些大片段可能会在成簇时跨孔长簇,导致这部分数据会被仪器过滤掉,影响数据产出;同时在测read2之前需要做反转,那么反转后的长片段形成的簇会变大,信号会减弱,机器在碱基识别时,准确率和Q30会降低,同时也会影响数据量。


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峰图过


文库片段大小的分布范围较宽,主要是由于片段打断条件不合适而导致文库中混有较大或较小的片段。这些较大或较小的文库片段会影响数据产出和Q30


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无目的峰


峰图上没有文库峰,只有markerladder,可能是浓度过低或建库失败导致的没有目的峰。


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文库浓度


文库浓度检测主要依赖于Qubit荧光计、实时荧光定量PCRqPCR)及生物分析仪等检测手段,其检测结果也会有摩尔浓度和质量浓度的区别,二者的换算关系如下:


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一般实验室在方法建立和性能确认过程中会对文库浓度有一个最低要求,qPCR浓度或Qubit定量大于相应值时认为文库量合格。浓度偏低的文库可能会定量不准,导致文库产出不稳定,官方检测的浓度范围是10-1000 nM,文库浓度小于10 nM会导致检测结果不准确;浓度偏低的文库上机会导致桥式PCR过程中形成的DNA样本簇减少,测序数据量也会减少;且浓度偏低的文库与正常文库pooling可能会拉低正常文库的pooling浓度,导致pooling浓度达不到上机要求,影响整条lane的数据产出。


文库碱基多样性


碱基多样性对Illumina测序平台生成有效的簇模板非常必要,对生成高质量的数据也十分重要。碱基多样性低的文库在信号读取时往往产生簇信号混杂,易产生低质量的数据。因此保证一定的碱基多样性尤为重要。对于一些已知低复杂性的文库样本,还可选择与phix文库或平衡文库混合检测,帮助平衡不平衡文库在每个循环测序时所缺少的荧光信号,进而有助于提高整个测序的质量和数据量。


诺基因可检测多种文库类型,包括碱基平衡文库及碱基不平衡文库;拨打安诺基因客服电话4008-986-980,我们会随时为您解答文库的相关问题,以获得更好的测序结果。

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