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想发高分paper? iTRAQ让你一步到位

2018-04-17

研究如何发paper可谓是科研小伙伴的每日必修课。每日三省吾身,什么时候可以发paper?发什么杂志?IF能有几分?但常常有人从长发飘飘熬到头发稀疏也发不出一篇高分paper。真是春蚕到死丝方尽,data总是不给力;问君能有几多愁,没有paper熬白头;物是人非事事休,项目基金大把丢……

说了这么多,是时候给大家安利一波“霸王防脱”!啊不,是神奇的iTRAQ定量蛋白质组技术,让你一步实验做完,高分paper到手!你说不可能?那是你还不知道来自iTRAQ的神秘力量。了解iTRAQ之前,让我们先回归正经,了解一下这股神秘力量的起源。

神秘力量之起源—蛋白质组时代已来

在后基因组时代,研究生命现象,阐释生命活动规律时,如果只了解基因组的结构那你就OUT了,当然还需对生命活动的直接执行者——蛋白质进行更深入的研究。

蛋白质组是指由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。基因在转录时,由于可变剪接现象的存在,一个蛋白质组往往不是一个基因组直接产物的简单集合。它会随着不同时间、不同组织部位甚至环境的改变而改变。

神秘力量之现身—iTRAQ技术原理

如果把蛋白质组学的研究进程比作攀登珠穆朗玛峰,那iTRAQ技术无疑是助力登顶的一大利器。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation),即同重标签标记的相对和绝对定量技术,是一种基于串联质谱(LC-MS/MS)检测,同时对多组研究样本进行蛋白质鉴定和定量的方法。

原理是通过稳定同位素对不同样本蛋白质酶解后的肽段进行标记,再根据不同标签离子的质谱峰强度进行样本间定量比较。iTRAQ试剂由三部分组成:报告基团、质量平衡基团和肽反应标记试剂基团,形成4种或8种相对分子质量均等量的异位标签。

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图1 iTRAQ试剂结构

iTRAQ试剂用于标记酶解后的肽段,标记试剂不影响肽段的质谱检测和匹配。在一级质谱中,由于被iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一肽段均表现为相同的质荷比,这些不同来源的相同肽段便表现为同一个峰。在二级质谱中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,带不同同位素标签的同一多肽产生质量为114,115,116和117Da(八标为113、114、115、116、117、118、119和121 Da)的报告离子,根据报告离子的强度值(波峰的高度和面积)可获得肽段的相对丰度,和同一蛋白在不同样本中的表达差异等定量信息。同时,肽段的串联质谱结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。

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图 2 iTRAQ技术原理

了解原理之后,这股神秘力量究竟可以带给我们什么呢?

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所以聪明的你只需把对照组和实验组的样本送过来,满满的data就到碗里来了!如果再经过Western Blot、PRM和功能验证等试验验证差异蛋白及其功能,那高分paper就妥妥到手~是不是so easy!

举个“栗子

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1、研究背景

高盐环境会大幅减少棉花产量,对棉花耐盐机制的理解有助于培育耐盐品种的棉花。

2、研究目的

利用iTRAQ技术在分子层面探究棉花的耐盐机制。


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图 3 研究思路图

这些植株经过0/4/24小时盐处理后,分别采集它们的叶片,每组样品设3个生物学重复。然后经过蛋白提取、iTRAQ试剂标记、质谱检测、数据过滤、生物信息分析等处理。

01-差异蛋白统计

本研究共识别115种差异蛋白,其中58种是盐胁迫应答蛋白,2种与磷酸代谢密切相关的差异蛋白显著上调,另外2种显著下调。根据这些数据可推测这几种蛋白在盐胁迫环境中对植株的生长存活起到重要作用。


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图 4 差异蛋白统计

02-差异蛋白GO分类和KEGG分析

针对115种差异蛋白进行GO和KEGG注释,其中GO分析显示这些差异蛋白主要集中在叶绿体和细胞质中,涉及的分子功能主要是离子结合相关功能,生物过程主要涉及应激反应等过程。KEGG的结果展示了这些差异蛋白主要参与的一些信号通路,比如卟啉和叶绿素的代谢通路。


1523930269416286.png图 5 差异蛋白GO分类和KEGG分析

03-蛋白互作网络分析

研究者利用拟南芥蛋白互作反应数据库,发现25个棉花的同源蛋白发生相互作用,其中钙调蛋白CAM7被预测有212个伴侣蛋白。下图是CAM7与其上下游蛋白的互作网络。


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图 6 蛋白互作网络分析

04-QRT-PCR验证差异蛋白和差异基因的一致性

通过蛋白质组和转录组的联合分析,作者发现16个差异蛋白与它们的差异基因表达水平一致,并进行了qRT-PCR验证。


9.png图 7 qRT-PCR验证差异蛋白和差异基因的一致性

经过小编的整理,你是不是发现超简单的~原来iTRAQ技术竟然是这么用的,聪明的你赶紧学起来吧~

文案:蛋白组产品经理 王思竞

设计:胡珊珊


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