Nature子刊丨Iso-Seq揭示心肌症发病全新机制
2020.05.15

DNA损伤是生物体内可以由多种外界刺激引发的DNA结构改变的现象,大量DNA损伤堆积会损害基因组的完整性,阻碍DNA复制和转录,甚至导致细胞凋亡。越来越多的证据表明DNA损伤在多种心血管疾病中增强,然而,目前为止对心肌细胞DNA修复机制的研究还不甚明晰。
此前,北京大学分子医学研究所张岩博士及其团队利用PacBio全长转录组测序,成功描绘了介导心肌细胞死亡的CaMKII-δ基因剪切全貌,明确了CaMKII-δ9在心脏组织中的主导地位,并通过CaMKII-δ9—UBE2T—DNA损伤通路干扰心肌细胞基因组的完整性,导致细胞凋亡和严重的心脏疾病,刷新了以往对CaMKII-δ2/δ3占主要地位的认知。

全长转录组揭示心脏DNA损伤诱发心肌症机制

文献名称:CaMKII-δ9 promotes cardiomyopathy through disrupting UBE2T-dependent DNA repair

发表时间:2019.09

发表期刊:Nature Cell Biology(17.728


研究背景

钙/钙调素蛋白激酶II(CaMKII)是一类多功能的丝/苏氨酸蛋白激酶,参与调节心脏细胞的死亡,它的过度激活与多种心脏病的发病机制有关,如心肌梗塞,心肌病和心力衰竭。


研究策略

样本选择:小鼠、大鼠、恒河猴和人的心脏组织

测序策略:PacBio SMRT测序


研究思路

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主要结果

01

CaMKII-δ9在心脏组织中广泛存在

CaMKII由四种基因编码,分别是CaMKII-α,β,γ和δ,其中CaMKII-δ主要在心脏中表达。CaMKII-δ可以在两个区域发生可变剪切,外显子13-17之间,以及外显子20-22之间,从而产生11种不同的剪切变体。以往的研究中认为,CaMKII-δ2和CaMKII-δ3是心脏中最主要的剪切变体,分别位于细胞质和细胞核,对心脏细胞活性有相反的功能影响。虽然越来越多的证据表明CaMKII-δ的过度激活会引发多种心脏疾病,如心肌缺血、心肌梗塞、心律失常、心肌肥厚和心力衰竭等,但由CaMKII-δ介导的致病机制还尚不清晰。

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CaMKII-δ可以在两个区域发生可变剪切生成11条不同的剪切变体

为破解由CaMKII-δ介导的致病机制,作者对小鼠、大鼠、恒河猴和人的心脏组织进行全长转录组分析,成功描绘了CaMKII-δ的剪切全貌。出乎意料的是,此前被认为广泛存在的CaMKII-δ2在恒河猴和人的心脏中出现的比例极低,而被忽视的CaMKII-δ9则表达量最为丰富,与CaMKII-δ3相当。之后作者通过RNA-seq、western blot、质谱等手段分别在mRNA和蛋白表达水平证实,CaMKII-δ9在哺乳类动物尤其是灵长类和人类的心脏组织细胞质中广泛存在。

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CaMKII-δ剪切面貌及在不同哺乳动物中的表达水平


02

CaMKII-δ9引发DNA损伤与细胞凋亡机制

磷酸化和氧化过程会激活CaMKII,CaMKII-δ9在心肌细胞中表达上调,与多种心脏疾病相关联,如主动脉狭窄、心肌肥大、动脉缺血/再灌注损伤等。

为探究CaMKII-δ9在调节心肌细胞方面的功能,作者设计了shRNA敲低CaMKII-δ9的表达,显著缓解了心肌细胞死亡的现象。此外,CaMKII-δ9过表达会引发心肌细胞急速死亡,较CaMKII-δ2的作用更为强烈,标志着CaMKII-δ9是引起氧化损伤和心肌肥大的重要致病因子。

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CaMKII-δ9引起心肌细胞凋亡

随后,作者对比了CaMKII-δ9和CaMKII-δ2过表达心肌细胞的基因表达模式,发现泛素耦联酶E2T(UBE2T)在CaMKII-δ9诱导的心肌细胞死亡中起关键作用。UBE2T参与范可尼贫血症的DNA修复通路,DNA修复缺陷和积累的DNA损伤会触发细胞凋亡。UBE2T过表达可造成心脏基因组不稳定,表达下调则会引起心肌细胞的DNA损伤堆积。因此CaMKII-δ9-UBE2T信号通路是调节心肌细胞DNA修复和基因组稳定性的重要机制,其功能失调会引发多种心脏疾病。

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CaMKII-δ9通过下调UBE2T干扰DNA损失修复

为进一步探究CaMKII-δ9在致病机制中的作用,作者构建了CaMKII-δ9过表达小鼠模型,模拟CaMKII-δ9在心肌症患者中的异常上调。这些小鼠的心脏功能随年龄恶化,在第10周时出现严重的心脏衰竭,表现为心脏功能不全、心室扩张和心壁变薄。重要的是,心脏DNA损伤明显增加,伴随着UBE2T蛋白丰度降低。而CaMKII-δ9敲除小鼠则表现出心肌肥厚、收缩功能障碍和过早死亡,UBE2T表达丰度也随之上升。因此,CaMKII-δ9介导的UBE2T下调是引发心脏DNA损伤、细胞凋亡和心肌病的关键机制。

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CaMKII-δ9—UBE2T—DNA损伤通路在心肌症与心脏衰竭中增强

心肌症患者的心肌组织中,也发现了CaMKII-δ9—UBE2T—DNA损伤通路的存在,CaMKII-δ9引发UBE2T的降解和随后的DNA损伤,强调了这条通路的病理学意义。

03

UBE2T的磷酸化与降解

CaMKII-δ9过表达的情况下,UBE2T在mRNA水平表达上调,但在蛋白质水平下调。利用蛋白酶抑制剂阻断CaMKII-δ9—UBE2T通路,发现UBE2T在细胞核中显著富集,而在细胞质中发生由CaMKII-δ9介导的降解现象。质谱分析的结果揭示了CaMKII-δ9促进UBE2T丝氨酸Ser110的磷酸化及随后的降解。

04

CaMKII-δ9与其它CaMKII-δ剪切变体的比较

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CaMKII-δ9介导DNA损伤与细胞凋亡通路

此外,作者还对CaMKII-δ9与CaMKII-δ2的功能进行了比较。CaMKII-δ2过表达小鼠模型表现出了较CaMKII-δ9小鼠轻微的同类症状,但并未引起UBE2T下调和DNA损伤积累。这些结果表明这两条剪切变体在心脏生理学和病理学中刺激不同的信号通路、行使不同的作用。在CaMKII-δ的众多变体中,UBE2T仅为CaMKII-δ9的底物,而与CaMKII-δ1、-δ2、-δ3不发生反应,因此外显子13-16-17编码的序列在底物选择方面发挥了作用。


文章小结

本文利用全长转录组测序技术确定了CaMKII-δ9在心脏中占据主要地位,推翻了此前CaMKII-δ2/δ3为主要心脏剪切变体的认知。CaMKII-δ9会促进UBE2T的磷酸化和降解,从而干扰DNA修复通路并导致心肌细胞凋亡和心脏疾病。本次研究不仅揭示了由CaMKII-δ9介导的心肌症致病机制,也强调了CaMKII-δ9可作为治疗心肌损伤和心脏衰竭的潜在重要靶点。


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参考文献

Zhang Mao,Gao Hua,Liu Dairu et al. CaMKII-δ9 promotes cardiomyopathy through disrupting UBE2T-dependent DNA repair[J] .Nat. Cell Biol., 2019, 21: 1152-1163.