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公司建立了包含PacBio Sequel、NovaSeq 6000、HiSeq X等

新一代测序仪的高通量测序平台,并与Illumina联合开发了

新一代桌面测序仪NextSeq 550AR,可以对DNA、RNA等不

同分子类型的样本进行测序分析,具备检测大批量样本的能力。

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蛋白转录联合分析如何发IF10+文章?

上期小编向大家介绍了转录组与蛋白组数据进行联合分析的诸多优势,详情回顾请戳“蛋白牵手转录组,双11优惠嗨不停”(本文末优惠持续放送哦~)。如何利用两组学联合分析发影响因子10+的文章呢?今天小编就以德国Falk Butter团队的两篇果蝇发育研究的文章为例,为大家解析蛋白组与转录组联合分析的文章思路。


蛋白质组揭示果蝇发育机制

The developmental proteome of Drosophila melanogaster


发表期刊:Genome Research

发表时间:2017 年 7 月

材料选择:果蝇完整发育周期(胚胎、幼虫、蛹、成虫)15个节点的组织样本


图1 果蝇发育样本选择

图1 果蝇发育样本选择[1]


实验设计


图2 实验设计思路图

图2 实验设计思路图


研究结果


果蝇完整生命周期的蛋白质组图谱


利用label free的方法对15个节点的果蝇样本进行5h的深度质谱检测,共检测到8549个蛋白,其中核心蛋白4627个(下图左),主要参与代谢和细胞系统的基础活动(下图中)。通过PCA分析显示来自相同发育阶段的蛋白呈现出清晰的蛋白聚类(下图右)。

 

 图3 果蝇发育生命周期蛋白质组特征[1]

图3 果蝇发育生命周期蛋白质组特征[1]


发育进程相关蛋白分析


通过ANOVA分析,作者发现了与发育进程相关的差异蛋白共1535个(下图左)。随后进行GO富集分析来建立蛋白与不同发育时期生物功能的联系:胚胎形成时期与有丝分裂调控、细胞周期、发育所需的激酶系统相关的蛋白得到显著富集。作者将胚胎发育的蛋白进行了区分:早期阶段(0-6h)主要有细胞骨架重塑蛋白、微管结合蛋白、翻译相关蛋白等的高表达,而晚期阶段(12-20h)主要是组织变态发育相关蛋白的高表达(下图右)。幼虫与蛹时期的蛋白主要与角质层结构成分有关。成虫时期,气味结合蛋白、光感蛋白、光传导蛋白、视网膜变性蛋白剧烈表达,与果蝇成虫形成完善的光感应系统呈现出一致性。

 

图4 发育进程相关蛋白分析

图4 发育进程相关蛋白分析[1]


联合分析研究翻译延迟


将胚胎发育蛋白质组与转录组数据进行联合分析,结果表明胚胎发育过程中蛋白的复杂性增加(下图A),转录组与蛋白质组只有中等相关性(最大R = 0.5),且最佳相关性非同步,蛋白组延迟约4-5h(下图B)。作者将mRNA /蛋白质表达谱分组成六个簇(下图C)。在大多数情况下,mRNA表达在早期时间点更丰富,而蛋白质表达在后期达到峰值,可能是由于翻译调控引起的。


 图5 转录-蛋白数据相关性分析

 图5 转录-蛋白数据相关性分析[1] 


本项研究收集了果蝇整个生命周期高质量的蛋白质组数据,填补了系统发育研究在蛋白质组水平的空白。此外,与转录组数据的比较,揭示了mRNA和蛋白质之间的差异相关性,强调了蛋白质组学在研究发育中的重要性。


转录组与蛋白组联合分析揭示果蝇发育的转录后调控机制

Quantifying post-transcriptional regulation in the development of Drosophila melanogaster


发表期刊: Nature Communications

发表时间: 2018 年 11 月

材料选择:果蝇产卵后14个时间节点的胚胎


图6 果蝇胚胎样品选择

图6 果蝇胚胎样品选择[2]



实验设计


图7 实验设计图

图7 实验设计图


实验结果


转录组与蛋白组相关性分析

作者对14个时间节点的样品进行了转录组测序和蛋白质组检测,并对两组学数据进行了相关性分析。作者将3761个成对RNA-蛋白进行了聚类分析,共得到4类表达相关性的变化:525个mRNA与其蛋白协同上调,1063个mRNA与其蛋白协同下调,372个mRNA上调其蛋白下调,1801个mRNA下调其蛋白上调。共有58%的mRNA与其蛋白呈现相反的表达丰度,表明mRNA的动态表达与其对应的蛋白并不直接相关。


图8 成对RNA-蛋白的聚类分析

图8 成对RNA-蛋白的聚类分析[2] 


相关性量化分析


为量化mRNA与蛋白丰度间的关系,作者计算了Spearman相关系数:mRNA与蛋白的同步平均相关性最大值出现在14h(下图a);非同步相关性最高值出现在mRNA 12h与蛋白16h (下图b)。mRNA与较晚时间点的蛋白呈现更好地相关性,很可能是因为蛋白合成中的延迟,当蛋白表达落后于mRNA 4-6小时的情况下,两者间的相关性最高(下图c)。


图9 相关性量化分析

图9 相关性量化分析[2]


调控场景分类


尽管mRNA与蛋白间的相关性有限,作者通过构建数学模型,将84%的mRNA-蛋白对根据不同的时间进程划分为了4个主要的调控场景,包括蛋白合成、延迟合成、静止和降解(下图a、b)。剩余的16%成对mRNA-蛋白与以上模型均不相符(Rejected),表明这些蛋白经历了复杂的转录后调控。


图10 蛋白调控场景分类

图10 蛋白调控场景分类[2]


各调控场景蛋白功能富集分析


随后作者对各个调控类型的蛋白进行了GO分析,探究其特有的生物活动。合成模式中的蛋白在mRNA加工、剪切和RNA代谢活动中富集,表明这些蛋白中存在转录后基因表达的关键调控因子。延迟合成模式中的蛋白则在蛋白分解代谢中富集,暗示在MZT初期,调节母本蛋白降解的因子广泛表达。在Rejected模式中与细胞周期有关的基因发生富集。


图11 蛋白功能富集分析

图11 蛋白功能富集分析[2]


本篇文章分析了大规模的、基于时间序列的果蝇胚胎转录组和蛋白质组数据,为研究转录后基因调控呈现了系统生物学的框架。

 

小结


Falk Butter团队利用蛋白质组技术填补了果蝇系统发育的研究空白,与转录组数据的联合分析为大规模研究转录后调控提供了新思路。随着科研水平的发展,仅从单一组学角度已难以解释许多生物学问题,多组学联合分析因其可以在整体水平解析生物体复杂的生理、病理问题,逐渐成为科研工作者们的新宠。 

 

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参考文献


[1]Casas-Vila N, Bluhm A, Sayols S, et al. The developmental proteome of Drosophila melanogaster[J]. Genome Research, 2017, 27(7):1273.


[2]Becker Kolja, Bluhm Alina, Casas-Vila Nuria, et al. Quantifying post-transcriptional regulation in the development of Drosophila melanogaster. Nature Communications, 2018, 9, 4970.


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文库测序十问十答


从核酸提取、文库构建,到上机测序、数据分析,越来越多的实验室选择将这些决定实验命运的关键步骤掌控在自己手中。下面就由小编带大家看一看自建库和测序过程中有哪些需要特别注意的环节,干货满满,不要错过哦~


问:常规Illumina NGS文库长什么样?

图1 单端index文库测序模式图

图1 单端index文库测序模式图


图2 双端index文库测序模式图(NovaSeq 6000平台)

图2 双端index文库测序模式图(NovaSeq 6000平台)


图3 双端index文库测序模式图(HiSeq X平台)

图3 双端index文库测序模式图(HiSeq X平台)


答:如图,文库结构可分为以下几个部分:插入片段,P5、P7接头,测序引物结合位点及index。

其中P5、P7接头位于文库两端,可以与flowcell上的寡核苷酸结合,在簇生成和测序过程中可作为引物或起到固定模板链的作用。

Index是不同样本的区分依据,当同一条lane中混入多个样本测序时,即可根据index区分来自不同样本的reads。根据建库时使用接头结构不同,又分为单index文库和双index文库。随着测序通量的不断增加,每条lane可以容纳的样本量也越来越多,双index可以变化出更多种组合,且能够降低标签串扰的比例,因此一些对灵敏度要求较高的检测通常会构建双index文库[1]。

图中黄色和蓝色的部分是测序引物结合位点,相信机智的你一定发现了:index5在NovaSeq 6000和HiSeq X平台的测序方向是不同的。完成Read1、index7测序之后,NovaSeq 6000平台会继续以这条链为模板进行index5的测序,测序引物是flowcell上的P5接头,因此index5的测序方向和Read1、index7是一致的。而HiSeq X平台的index5、Read2测序则是在末端翻转后进行的,因此index5的测序方向与Read2一致,而与Read1、index7相反,同样的index5在HiSeq X和NovaSeq 6000平台测得的序列是反向互补的,因此在填写文库信息的时候一定要注意测序平台和序列的对应关系。


问:文库构建的主要步骤?

答:以基因组DNA为例,构建DNA小片段文库的主要步骤如下:1)使用转座酶或超声波将基因组DNA打断;2)末端修复;3)3’端加A;4)接头上3’端突出的T碱基与待测片段3’端的A碱基互补配对,为待测片段两端添加上接头;5)连接接头后纯化;6)PCR扩增;7)PCR后纯化。


问:碱基不平衡对测序结果的影响?

答:Illumina 测序仪在收集信号时,并不是拍摄一张彩色照片一次完成的,而是分 A、C、G、T 4 个波长,分别拍摄 4 张单色照片,然后通过软件处理把这 4 张图叠加成一张。这是一种权宜之计,目的是减少图片文件的大小,从而降低对于数据存贮空间的要求。但也有缺点,一旦某一张或几张照片的信号强度不够,或者没有信号,则图片的叠加就不能准确完成。碱基不平衡文库(即A、G、C、T 四种碱基的含量远远偏离 25%)在测序时会导致某些图片(波长)没有信号或者信号很弱,在碱基识别时准确性降低。常见的碱基不平衡文库有BS甲基化文库、单细胞转录组文库、PCR产物文库等,为了减少碱基不平衡对测序结果的影响,通常会混入一定比例的phix文库。


问:Phix文库的作用?

答:Phix 文库是校准文库,是 illumina 的一种试剂,来源于病毒基因组DNA。其基因序列已精确知晓,GC 比例约为 40%,与人类、哺乳类的基因组的 GC 比例接近。其基因序列又与人类的基因序列相去甚远,且不含有index。在与哺乳类基因组一起测序时,可以通过基因序列比对或数据拆分而将之去除。在测碱基不平衡的文库样本时,可以加入大量的 phix 文库,以部分抵消样本的不平衡性。也可以少量地加入phix文库,以作为 control library 来验证测序质量。


问:Index可以容纳多少种文库?

答:以8碱基index为例,单端index文库理论上可以有4^8=65536种index,双端index文库理论上可以有65536^2=4294967296种index,但实际pooling时为了避免因对焦不准造成index读错,造成数据无法拆分,需要使用碱基分布均匀的index。


问:文库质检的方法?

答:上机前我们会使用Aglient 2100或LabChip GX Touch生物芯片分析系统检测文库片段大小,并使用StepOnePlusTM Real-Time PCR System,以P5、P7接头作为引物进行QPCR定量。由于Illumina文库开始测序之前会先以P5、P7接头为引物进行桥式PCR,在flowcell上生成簇,因此这样的上机定量结果是比较准确的。


问:文库pooling的原则?

答:不同文库应按照有效浓度和目标下机数据量pooling,即各文库混合后摩尔浓度比=需求数据量比。除此之外还需要考虑index的碱基分布,如同1条lane中同一个位置的同一种碱基占比最好在50%以下,每3位中至少有1位碱基不同,不同文库的index应至少有2个碱基的差异等。


问:文库测序过滤内容和参数?

答:1)去除低质量的reads:reads中质量值Q≤19的碱基占总碱基的50%以上则舍弃该条read,对于双端测序,若一端为低质量reads,则会去掉两端reads;2)去除接头污染的reads:reads中接头污染的碱基数大于5bp则舍弃该条read,对于双端测序,若一端受到接头污染,则去掉两端的reads;3)去除含N较多的reads:reads中读N碱基比例大于5%则舍弃该条read,对于双端测序,若一端含N比例大于5%,则会去掉两端reads。


问:测序中的Duplication是什么?

答:Duplication是指起始与终止位置完全一致的片段。引起Duplication的主要原因是在测序中有PCR过程,来源于同一个DNA片段PCR的产物被重复测序,就会产生duplication。次要原因是正巧两个插入片段的头和尾的位置完全一致,导致这一现象可能的原因有以下几种:a. 物种基因组小,本身的片段多样性低,测定的数据量多,重复的数据多;b. 建库过程中建库起始量少,片段多样性低,在相同的PCR条件下,会造成文库总量低,后期数据的dup率高;c.片段打断或加接头存在偏好性,文库的多样性较差。Dup率计算主要有以下2种方法:一种是数据质控时计算,利用 reads 序列来计算dup,要求 read 序列一样才算作duplication,duplicate reads数目除以总 reads数目计算比率;另一种是比对分析时计算,根据read比对上基因组的位置来判断,比对的位置一样就算作duplication,一般会有 2bp的容错。


问:HiSeq X和NovaSeq 6000数据产出水平如何?

答:对于质检合格的碱基平衡文库,使用PE150试剂测序,我们承诺HiSeq X平台数据产出≥120Gb/lane,NovaSeq 6000平台S4试剂数据产出≥850Gb/lane。实际统计HiSeq X平均每条lane数据产出145.71 Gb,平均Q30为93.8%;NovaSeq平均每条lane数据产出958Gb,平均Q30为93.0%,在碱基准确度、测序均一性、可用数据比例等方面均表现卓越。


图4 HiSeq X平台下机数据SAV图

图4 HiSeq X平台下机数据SAV图


图5 NovaSeq6000平台S4试剂下机数据SAV图

图5 NovaSeq6000平台S4试剂下机数据SAV图


看完小编整理的10个文库测序常见问题,你心中的疑惑是否已经有答案了呢~如果还有疑问,您还可以拨打安诺基因科服电话4008-986-980,我们随时为您解答~


参考文献

[1] Macconaill L E, Burns R T, NagA, et al. Unique, dual-indexed sequencing adapters with UMIs effectively eliminate index cross-talk and significantly improve sensitivity of massively parallel sequencing[J]. Bmc Genomics, 2018, 19(1):30.


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【校企双赢】安诺优达携手厦门大学公共卫生学院,共建大学生社会实践基地

20181212日,厦门大学公共卫生学院和浙江安诺优达生物科技有限公司校企合作签约授牌仪式在安诺优达南方中心隆重举行。义乌市副市长骆小俊,厦门大学公共卫生学院党委书记张琥、党委副书记黄兆君、实验医学系主任郑铁生、办公室主任张宇斌、实验医学系秘书安然,义乌经济技术开发区党工委委员、副主任王巍,安诺优达总裁陈重建、副总裁玄兆伶、南方中心总经理杨路民等出席仪式,共同见证了本次校企合作签约和授牌仪式。




厦门大学公共卫生学院党委书记张琥一行在安诺优达总裁陈重建、副总裁玄兆伶、安诺优达南方中心总经理杨路民等企业负责人的陪同下,首先参观了安诺优达南方中心基因科技展厅及科技服务平台。在负责人的详细介绍下,张琥书记等学校领导一行对安诺优达的发展历程、业务布局和未来产业发展方向有了全面的了解,并对安诺优达近几年所取得的成绩予以充分的肯定。


参观图片


参观图片


参观结束后,义乌副市长骆小俊、义乌经济技术开发区党工委委员、副主任王巍以及校企合作双方代表等出席签约仪式座谈会。会上,陈重建博士首先对厦门大学公共卫生学院张琥书记一行的到来表示热烈的欢迎。陈重建博士提出,希望通过建立大学生社会实践基地,为学生搭建优秀就业平台,提升学生实践能力,同时能够让企业吸引人才、培养人才、留住人才,实现真正意义上的校企双赢。


张琥书记表示,此次社会实践基地的建立,将为培养和提升学生的综合实践能力和创新精神搭建良好的平台,也为企业的发展提供了人才储备。他希望双方以共建社会实践基地为纽带,进一步增进了解、加深友谊、拓展合作,打开校企战略合作通道,谋求多方共赢。


仪式上,义乌副市长骆小俊、义乌经济技术开发区党工委委员、副主任王巍纷纷表示希望通过校企合作平台的搭建,不断优化营商环境,做好配套服务,同时也期盼下一步能够与厦门大学不断深化合作。


签约图片


在义乌市副市长骆小俊、义乌经济技术开发区党工委委员、副主任王巍以及校企合作双方代表的共同见证下,厦门大学公共卫生学院黄兆君副书记与安诺优达总裁陈重建签署了“大学生社会实践基地”协议书。随后,骆小俊副市长、张琥书记、陈重建总裁在安诺优达南方中心为大学生实践基地揭牌。


揭牌图片


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安诺转录组合作文章10连发

2018年即将结束,小伙伴们年初制定了很多计划,开展了很多工作,年底是收获的时候啦,最近安诺合作的文章见刊喜讯接踵而来,我们又新收录了多篇小伙伴们合作发表的文章,小编趁热打铁赶紧整理了一下,各位大佬走过路过不要错过哦~


合作发表的文章


下面我们选取其中4篇文章进行解读,来更深入地了解RNA-seq测序技术的应用。


转录组测序助力揭示SHQ1在RNA剪接和肿瘤发生中重要调控机制[1]


SHQ1 regulation of RNA splicing is required for T-lymphoblastic leukemia cell survival[1]


01 发表期刊

Nature Communications

02 合作单位

武汉大学

03 研究结果

急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种恶性侵袭性血液肿瘤疾病,本研究发现SHQ1在T-ALL中高度表达,SHQ1缺失会诱导T-ALL细胞的死亡,增加动物存活率。为阐释具体作用机制,作者利用RNA-seq发现缺失SHQ1会影响RNA的正常剪接,而MYC也会因剪接效率低而显著下调,相应地过表达MYC可显著挽救SHQ1失活引起的T-ALL细胞死亡。在T-ALL中NOTCH1能结合SHQ1的启动子区域激活SHQ1表达,进而调控MYC表达。综上所述,本研究不仅发现了SHQ1在RNA剪接和肿瘤发生中的作用,也阐明了NOTCH1–SHQ1–MYC调控通路,为研究 MYC基因的表达调控提供了新的思路。

 

图1 缺失SHQ1影响pre-mRNA剪接

图1 缺失SHQ1影响pre-mRNA剪接[1]


鸡马立克氏病早期感染和发展过程中脾脏转录组的动态变化[5]


Dynamic Changes in the Splenic Transcriptome of Chickens during the Early Infection and Progress of Marek’s Disease [5]


01 发表期刊

Scientific Reports

02 合作单位

西北农林科技大学

03 研究结果

Gallid alphaherpes virus 2(GaHV2)是一种致癌的禽疱疹病毒,可诱导马立克氏病(MD)和快速发作的T细胞淋巴瘤。为了揭示MD发病机制,利用RNA-seq测定了早期和致病期感染GaHV2的鸡的脾的动态转录组。基于显著的差异表达基因(DEGs),GO富集分析,KEGG富集分析和蛋白互作网络分析,证明在GaHV2感染期间发生的分子事件与疾病发生发展过程高度相关,为进一步研究MD奠定了基础。

 

图2 TCGA数据库数据与RNA-seq测序数据比较

图2 TCGA数据库数据与RNA-seq测序数据比较[5]


ZEB1在人胚胎干细胞神经分化中的功能研究[6]


Zinc finger E-box-binding homeobox 1 (ZEB1) is required for neural differentiation of human embryonic stem cells[6]


01 发表期刊

Journal of Biological Chemistry

02 合作单位

中国科学院动物研究所

03 研究结果

ZEB1在人胚胎干细胞(hESCs)分化为神经元前体时高度表达。CRISPR / Cas9介导的ZEB1缺失可阻止hESCs衍生的神经前体分化为神经元,为了研究ZEB1在该过程中的功能,进行RNA测序分析,聚类和主成分分析(PCA)均表明基因表达模式在25d分化后发生显著变化,GO分析发现在ZEB1敲除后大多数差异基因富集到神经元分化相关条目且显著下调,证明ZEB1是神经元分化所必需的。ZEB1过表达不仅能够加速神经分化和神经元成熟,确保神经细胞移植更安全,而且能够促进兴奋性皮质神经元的产生,对于治疗某些神经系统疾病有重要价值,如帕金森病(PD),肌萎缩侧索硬化症(ALS)。该研究揭示了人类神经细胞的产生机制,有助于改进神经系统疾病患者的治疗方法,以及开发新的替代疗法。

 

图3 全基因组RNA测序分析及qRT-PCR验证

图3 全基因组RNA测序分析及qRT-PCR验证[6]


禽网状内皮组织增生病毒和禽白血病病毒J亚群协同增加外泌体miRNA积累[7]


Reticuloendotheliosis virus and avian leukosis virus subgroup J synergistically increase the accumulation of exosomal miRNAs[7]

 

01 发表期刊

Retrovirology

02 合作单位

山东农业大学

03 研究结果

禽白血病病毒亚群J(ALV-J)和网状内皮组织增生病毒(REV)共感染会协同致病并增加动物死亡率。然而,外泌体miRNA在两种病毒协同感染的致病分子机制中的作用仍然是未知的。在该研究中,通过对在最佳感染时间共感染两种病毒以及单一感染ALV-J和REV的CEF细胞的外泌体RNA,进行RNA深度测序分析,分别鉴定到54种和16种差异表达miRNA。此外,通过qRT-PCR在CEF细胞和外泌体中验证了五种关键miRNA。对miRNA靶基因的GO注释和KEGG通路分析表明5种差异表达的miRNA参与病毒-载体相互作用,氧化磷酸化,能量代谢和细胞生长。本文证明了REV和ALV-J协同感染增加外泌体miRNA的积累,这有利于进一步探索ALV-J与REV协同感染的机制。

  

图4 差异表达miRNA预测靶基因的GO注释和KEGG通路分析


图4 差异表达miRNA预测靶基因的GO注释和KEGG通路分析

图4 差异表达miRNA预测靶基因的GO注释和KEGG通路分析[7]


希望以上文献汇总能帮助大家更全面的了解RNA-seq技术,欢迎感兴趣的老师随时与我们联系。我们接下来还会不定期更新合作文章的解读,敬请期待哦!


参考文献

[1] Su H, Hu J, Huang L, et al. SHQ1 regulation of RNA splicing is required for T-lymphoblastic leukemia cell survival[J]. Nature Communications. 2018.

[2] Zhou C, Gao X, Hu S, et al. RBM-5 modulates U2AF large subunit-dependent alternative splicing in C. elegans[J]. RNA Biology, 2018.

[3] Zhou TC, Li X, Chen LJ, et al. Differential expression profile of hepatic circular RNAs in chronic hepatitis B[J]. J Viral Hepat. 2018.

[4] Hu Y, He C, Liu JP, et al. Analysis of key genes and signaling pathways involved in Helicobacter pylori-associated gastric cancer based on The Cancer Genome Atlas database and RNA sequencing data[J]. Helicobacter. 2018.

[5] Dang L, Teng M, Li HW, et al. Dynamic Changes in the Splenic Transcriptome of Chickens during the Early Infection and Progress of Marek’s Disease[J]. Scientific Reports. 2017.

[6] Jiang Y, Yan L, Xia L, et al. Zinc finger E-box-binding homeobox 1 (ZEB1) is required for neural differentiation of human embryonic stem cells[J]. J Biol Chem. 2018.

[7] Zhou D, Xue J, He S, et al. Reticuloendotheliosis virus and avian leukosis virus subgroup J synergistically increase the accumulation of exosomal miRNAs.[J]. Retrovirology. 2018.

[8] Bai S, Liu W, Wang H, et al. Enhanced Herbicide Metabolism and Metabolic Resistance Genes Identified in Tribenuron-Methyl Resistant Myosoton aquaticum L.[J]. J Agric Food Chem. 2018.

[9] Zheng Y, Chen C, Liang Y, et al. Genome-wide association analysis of the lipid and fatty acid metabolism regulatory network in the mesocarp of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) based on small noncoding RNA sequencing[J]. Tree Physiol. 2018.

[10] Guo F, Hong W, Yang M, et al. Upregulation of 24(R/S), 25-epoxycholesterol and 27-hydroxycholesterol suppresses the proliferation and migration of gastric cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun. 2018.


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